В генетическом разнообразии вирусов в природе, особенно корона-, флави- и тогавирусов, важную роль играет рекомбинация. Она может происходить не только между близкородственными, но и отдаленно родственными вирусами [1727].
Важным достижением технологии рекомбинантной ДНК явилось открытие возможности замены удаленного гена чужеродным геном. Этот метод использу
ет вирусы как векторы для переноса генов протективных антигенов других вирусов. В геном авирулентного вируса вставляют ген интересующего вируса, кодирующий антиген, вызывающий протективный ответ в привитом организме.
Модифицированный таким образом авирулентный вирус используют как живую вирусную вакцину. Клетки, в которых векторный вирус реплицируется in vivo, экспрессируют чужеродный белок, вызывающий гуморальный и опосредованный клетками иммунный ответ на данный белок [ 1130].
Вирусные химеры, как вакцины с репликативным механизмом одного вируса и протективными антигенами другого, являются быстрой формой векторных вакцин. Прообразом таких вакцин можно считать реассортантные вакцины.
Вирус осповакцины был одним из первых вирусов, на примере которого была показана возможность такой замены без потери жизнеспособности рекомбинантного вируса с экспрессией белка, кодируемого чужеродным геном и индукцией иммунитета на этот белок. Подход к получению безопасной эффективной живой вакцины заключается в использовании стабильного вакцинного вирусного штамма для создания рекомбинантов, которые экспрессируют протективные антигены других вирусов, против которых желательно создать иммунитет. Члены семейства вирусов оспы оказались удобными для получения рекомбинантных гибридов, благодаря их большому геному, позволяющему удалять значительные участки ДНК без потери способности к репликации.
Гены, кодирующие различные антигены многих вирусов, были включены в геном вируса осповакцины. Прививка животных этими рекомбинантными векторными вакцинами каждый раз сопровождалась хорошим антительным ответом. Например, вирус осповакцины, использованный в качестве вектора вакцины против бешенства, будучи включенным в приманку для скармливания, защищал лис и хорьков от бешенства. Возможность включения нескольких генов, кодирующих соответствующие иммуногены, позволяет создать новый тип комбинированных (поливалентных) вакцин.
Потенциальными векторами являются многие ДНК-содержащие вирусы, реплицирующиеся в ядре или цитоплазме. Первые во многих случаях могут быть интегрированы в клеточную ДНК, что может привести к персистенции вируса и клеточной трансформации. Этот факт — хороший аргумент в пользу выбора «цитоплазматических» вирусов, таких как вирусы оспы, которые являются наиболее крупными вирусами животных.
Участок генома вирусов оспы, кодирующий тимидинкиназу, не является геномом, функция которого жизненно необходима для размножения вируса, и его можно заменять на чужеродные ДНК.
Чужеродные белки, экспрессирующиеся рекомбинантным вирусом оспы, сохраняют свои антигенные свойства [41] и способность формировать вирион- ную структуру.
Использование этого вируса в качестве вектора для вакцинации имеет ряд преимуществ: способность размножаться в клетках многих видов животных, экспрессировать несколько генов, индуцировать гуморальный и опосредован
ный клетками иммунитет, термостабильность, экономичность производства и легкость применения [1106].
В качестве векторов для создания живых рекомбинантных вакцин могут быть использованы адено-, бакуло- и герпесвирусы. Они, как и вирусы оспы, имеют крупный геном, — по крайней мере с одной несущественной областью для репликации и несколькими участками, в которые могут быть встроены чужеродные гены и экспрессированы без потери инфекционное™. В качестве векторов успешно используют вирусы оспы птиц.
Рекомбинантные живые вакцины по существу сочетают в себе свойства живых и компонентных вакцин. Проблема использования вектора живых вакцин в основном аналогична. Основное различие с живыми вакцинами заключается в том, что экспрессируется только один или несколько селективных генов, реплицируемых вместе с геномом вектора. В этом смысле, данные вакцины похожи на традиционные субъединичные (компонентные), но отличаются от них лишь тем, что являются «реплицирующимися антигенами». Рекомбинантные векторные вакцины как бы сочетают в себе положительные качества живых и инактивированных вакцин. При репликации в организме рекомбинантного вируса с встроенным чужеродным геном, кодирующим синтез гликопротеина, который может быть экспрессирован на поверхности клеток и может индуцировать развитие как гуморального, так и клеточного иммунного ответа. Субъединичные вакцины могут индуцировать развитие только гуморального иммунного ответа [11671.
Использование вируса осповакцины или других аттенуированных векторов для создания реплицирующихся субъединичных (компонентных) вакцин - новое перспективное направление молекулярной биологии и генной инженерии. В последнее время этот метод получил широкое применение в разработке нового поколения вакцин против различных вирусных заболеваний. Естественно, что становление принципиально нового направления создания вакцин сопряжено со многими трудностями. Однако на главный и принципиальный вопрос — способны ли рекомбинантные вакцины вызывать выраженный и длительный иммунитет — получен положительный ответ. Накопилось много данных о получении рекомбинантных вакцин, особенно на основе вируса осповакцины, содержащих гены различных вирусов, об их антигенной и иммуногенной активности при испытании в лабораторных и практических условиях.
Рекомбинанты респираторно-синцитиального (PC) вируса получены встраиванием ДНК-копий РНК, кодирующих G- или F-белки, в тимидинкиназный ген вируса осповакцины. Такие рекомбинанты, размножаясь в клетках животных, экспрессировали на их поверхности гликопротеины, аутентичные гликопротеинам РС-вируса. У хлопковых крыс, привитых внутримышечно рекомбинантами, обнаружен высокий уровень специфических вируснейтрализующих антител. Рекомбинантная вакцина PCB-F, экспрессирующая F белок, обладала более выраженным протективным эффектом [146].
Испытания, проведенные на пяти видах низших приматов, показали безопасность и иммуногенность таких рекомбинантных вакцин [471]. Рекомбинан
ты, экспрессирующие другие семь вирусспецифических белков, оказались не- иммуногенными или слабоиммуногенными.
Иммунизация крыс и обезьян рекомбинантным вирусом осповакцины, экспрессирующим белки HN и F вируса парагриппа-3, сопровождалась образованием высокого уровня вируснейтрализующих антител и устойчивостью к заражению вирусом парагриппа-3. Рекомбинантный вирус ПГ-3 крупного рогатого скота и ПГ-3 человека (В/Н PIV3) с встроенными и экспрессирующимися генами белков G и F респираторно-синциального вируса хорошо размножался в респираторном тракте хомяков, с образованием антител, и создал защиту при экспериментальном заражении хомяков всеми тремя вирусами [1413].
Рекомбинантная осповакцина, экспрессирующая F- и НА-гены вируса чумы КРС, оказалась иммуногенной для естественно восприимчивых животных [1703]. Опыты на кроликах показали, что для защиты было достаточно экспрессии только F-белка. Положительные результаты иммунизации получены при испытании аналогичной вакцины на зебу [1610].
Рекомбинантный вирус оспы кур содержал ген, кодирующий белок слияния вируса кори. Иммунизация этим вирусом защищала мышей от летальной инфекции при интрацеребральном заражении вирусом кори, хотя устойчивость к заражению не сопровождалась выраженной сероконверсией [1656].
На основе вируса оспы кур получены рекомбинантные вирусы, экспрессирующие ген HN вируса ньюкаслской болезни. Такие рекомбинанты обладали выраженными превентивными свойствами, вызывая иммунитет практически у всей птицы, иммунизированной внутримышечно. Вакцинация смесью рекомбинантных вирусов, экспрессирующих гемагглютинин-нейраминидазу и гликопротеин F, не усиливала защитного эффекта [623].
Аналогичными качествами обладал рекомбинантный вирус оспы голубей, эскпрессирующий белок слияния F вируса ньюкаслской болезни. Этот белок оказался гликозилированным и расщепленным (F1 и F2). Вакцинация кур рекомбинантным вирусом создавала выраженный иммунитет и образование антител к F-белку. Установлена корреляция между протективной активностью и уровнем таких антител. Однако вакцинация не приводила к образованию вируснейтрализующих антител [943].
При использовании обычных вакцин невозможно отличать вакцинированную птицу от птицы инфицированной. Применение рекомбинантной вакцины позволяет это сделать путем выявления антител ко всем протеинам вируса (инфицирование) или к отдельным протеинам (вакцинация) [650]. Рекомбинантный вирус оспы птиц, экспрессирующий капсидный белок Р-2 вируса инфекционной болезни бурсы, защищал кур от летальной инфекции, но не от поражения бурсы Фабрициуса [310].
Рекомбинантные вакцины были созданы путем вставки Н и/или F генов вируса чумы КРС (ЧКРС) в вирус осповакцины в качестве вектора [1590, 1696]. Рекомбинантный вирус с аналогичными свойствами (CPV) получен при использовании вируса оспы канареек в качестве вектора.
Сконструирован химерный вирус, содержащий гены вакцинного штамма SA-14-14-2 вируса японского энцефалита и гены инфекционного клона 17D вируса желтой лихорадки. Химерный вирус размножался с высоким титром в культуре клеток, был авирулентным при интрацеребральном введении мышам и обладал выраженной иммуногенностью. Авирулентный фенотип химерного вируса сохранялся после 6 пассажей в головном мозге мышей [745а].
Рекомбинантный вирус оспы птиц, экспрессирующий ген гликопротеина В вируса болезни Марека оказался безопасным и защищал цыплят от заболевания [1230]. На основе вируса оспы птиц получена рекомбинантная вакцина против геморрагического энтерита индеек (аденовирус птиц тип 2), экспрессирущая белок гексонов [449]. Рекомбинантная вакцина по антигенности и иммуногеннос- ти не уступала коммерческой традиционной вакцине, но в отличие от нее не вызывала иммуносупрессии [745а].
Рекомбинанты вируса осповакцины, экспрессирующие гликопротеины В, D, Е, G, I вируса простого герпеса испытывали на мышах для сравнения имму- ногенности индивидуальных гликопротеинов. Гликопротеины D и В индуцировали выраженный синтез антител и повышали уровень элиминации вируса, а также защищали от развития латентного носительства ВПГ-1 в чувствительных ганглиях. Гликопротеин Е был слабым индуктором нейтрализующих АТ, а глико- протены G, Н и I вовсе не вызывали образования нейтрализующих АТ и не предотвращали латентное инфицирование ганглиев [353].
Варианты рекомбинантной вакцины против японского энцефалита созданы на основе вируса осповакцины. Они обеспечивали синтез гликозилированного неструктурного белка NS-1 и гликозилированного белка Е оболочки вириона. Рекомбинанты, экспрессирующие тот и другой вирусные белки, обладали высокой иммуногенностью. Две инъекции вакцины защищали мышей от 104ЛД50 вируса японского энцефалита. Высокий уровень защиты коррелировал с высоким уровнем АТ, обладающих нейтрализующей активностью и активностью в РТГА [1019].
Рекомбинанты вируса осповакцины, содержащие в геноме различные сочетания генов С, М, Е, NS-1 вируса клещевого энцефалита, размножали в культуре клеток CV-1. Двукратное введение мышам вируса, экспрессирующего белок Е оболочки вируса клещевого энцефалита, защищало их при контрольном заражении гомологичным вирулентным вирусом [15].
Гены структурных белков вируса классической чумы свиней были встроены в ген тимидинкиназы вируса осповакцины. В культуре клеток CV-1 рекомбинантный вирус экспрессировал все четыре структурных белка вируса чумы, которые по основным свойствам не отличались от соответствующих вирионных белков. Иммунизация рекомбинантным вирусом надежно защищала свиней от инфицирования вирулентным вирусом [1348]. Сконструирован рекомбинантный вирус осповакцины, экспрессирующий основной белок оболочки вируса лейкоза крупного рогатого скота. Иммунизация телят таким вирусом оказывала лишь частичный защитный эффект. Аналогичные результаты получены в других исследованиях при испытании рекомбинантного вируса на овцах.
Мыши, иммунизированные рекомбинантным вирусом осповакцины, кодирующим неструктурный белок NS-1 вируса денге, были полностью защищены от летального энцефалита при последующем заражении вирулентным вирусом [656]. В ген gill аттенуированного вакцинного штамма вируса инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота встроены последовательности кДНК, кодирующие мономерные и димерные формы эпитопов белка VP1 вируса ящура. Такая вакцина вызывала иммунитет к вирусу ринотрахеита и выработку антител против ящура [891].
Рекомбинантный бакуловирус экспрессировал капсидный белок VP 2 вируса катаральной лихорадки овец в иммуногенной форме. Добавление структурного белка VP5 усиливало иммуногенный эффект [1345].
С целью создания эффективной, безопасной и экономичной антирабичес- кой вакцины для профилактической иммунизации людей и животных получен рекомбинантный аденовирус серотипа-5 человека, содержащий ген гликопротеина вируса бешенства. Иммунизированные им мыши были защищены от летальной интрацеребральной инфекции [1272].
Получен рекомбинантный вирус осповакцины, содержащий одновременно участки генома вирусов гепатита В, гриппа и герпеса простого, который экспрессировал HBsAg вируса гепатита В, гемагглютинин — вируса гриппа и гликопротеин D вируса герпеса простого [41].
Таким образом, в качестве векторов для создания рекомбинантных вакцин используют различные стабильные аттенуированные вирусы. Наибольший успех был достигнут при использовании вируса осповакцины в качестве рекомбинантного вектора. Такой рекомбинантный вирус мог экспрессировать протективные антигены большого количества вирусов, в том числе его использовали для иммунизации против бешенства. Вставка гена гликопротеина вируса бешенства в ген тимидинкиназы вируса вакцины приводит к снижению его вирулентности. В силу того, что геном вируса осповакцины способен включать много чужеродных генов без потери способности формировать вирионную структуру, теоретически возможно конструировать в качестве вектора один рекомбинантный вирус, способный защищать против нескольких вирусных болезней.
Использование вируса оспы птиц в качестве вектора при создании рекомбинантных вакцин для птиц представлялось весьма логичным. Однако большим сюрпризом оказалось то, что вирус оспы птиц может служить вектором при имм- мунизации млекопитающих. Допускается возможность, что этот вирус и тесно связанный с ним вирус оспы канареек, также используемый в качестве вектора, не реплицируются с образованием инфекционного вируса в клетках млекопитающих, но включенные в их геном чужеродные гены экспрессируются и вызывают специфический иммунный ответ.
Возможно, что такие векторы вызывают абортивную инфекцию in vivo с экспрессией чужеродных антигенов, вызывая клеточный и гуморальный иммунитет. Такие нереплицирующие векторы являются безопасными для иммуносу- прессивных хозяев.
Необходимо иметь в виду, что введение рекомбинантных живых вакцин в организм может вызывать иммунный ответ как против вируса донора чужеродного гена, так и против векторного вируса. Однако непохоже, чтобы рекомбинантные субъединичные вакцины были эффективнее рекомбинантных векторных вакцин, ограниченных однократным применением из-за развития иммунитета к векторному вирусу.
Отдельные векторные вакцины применяют в полевых условиях. Это вакцина против бешенства лис, применяемая для профилактики бешенства в Европе, и вакцина против бешенства хорьков, применяемая в США. Вакцина против чумы КРС (основанная на вирусе осповакцины и вирусе оспы коз) применяется в Африке. Недавние исследования подтвердили, что адено-, герпес- и парвовирусы могут также служить векторами и могут иметь преимущества в экспресии генов гетерологичных вирусов.