Наибольшее применение в вирусологической практике получили однослойные культуры. В производстве вирусных вакцин, особенно медицинского назначения, до недавнего времени использовали преимущественно однослойные первичные культуры и реже культуры диплоидных клеток. Многие вакцины, используемые в животноводстве, давно готовят с применением постоянных линий клеток.
Для производства живых и инактивированных вакцин во многих странах налажено крупномасштабное производство однослойных культур.
В 1954—1967 гг. в США произведено около 1000 т вирусной суспензии в однослойной первичной культуре клеток почек обезьян. Ее в основном использовали для приготовления инактивированной вакцины против полиомиелита и в меньшей степени для коревой и аденовирусной вакцин.
С технологической точки зрения при промышленном производстве вирусных вакцин наибольший интерес представляет высокая эффективность выращивания клеток и максимальный выход вируса или вирусного антигена. В случае приготовления первичных культур особое внимание следует уделять состоянию животных — доноров ткани.
Известен ряд критических факторов, которые следует учитывать при производстве культуральных вирусных вакцин на основе первичных культур.
Приготовление однослойных культур — трудоемкий процесс. Большие масштабы производства многих культуральных инактивированных вакцин привели к необходимости совершенствования технологии их приготовления.
Технологическая линия для массового выращивания вируса ящура в первичной однослойной культуре клеток почек телят в матрасах Ру емкостью 1 л, смонтированная в 1958 г. в Италии, позволяла получить в неделю 300—400 л вирусной суспензии с титром 107—107,5. Многие технологические процессы были механизированы и дали возможность повысить производительность метода. Однако масштабы производства вирусного сырья и повышение качества инактивированных вакцин требовали дальнейшего совершенствования аппаратуры и технологии промышленных способов выращивания вирусов.
Важным шагом в усовершенствовании метода однослойных культур явилось выращивание клеток во вращающихся круглостенных сосудах. При этом значительно увеличилось соотношение поверхности культивирования (см2) к объему среды (мл), которое достигало примерно 10. Высокая концентрация клеток (8х 10б клеток ВНК и 2,4х106 клеток почки теленка) на 1 мл поддерживающей среды неизбежно сказалась на повышении активности вирусных антигенов [143]. Благодаря аппаратурно-технологическим разработкам производительность метода выращивания однослойных культур достигала высокого уровня. Все операции, связанные с подготовкой посуды, выращиванием клеток и получением вируса, были механизированы. Вращающиеся литровые сосуды с культурой помещали в цилиндрические проволочные кассеты (по 18 в каждую). Кассеты укладывали на стеллажи с вращающимися вальцами. Одна пятиярусная рол-
лерная установка одновременно вмещала 400 проволочных кассет с 7200 вращающимися сосудами. В институте зоопрофилактики в Брешия (Италия) было смонтировано четыре таких установки на 2800 1-литровых бутылей [143].
До сих пор этот метод с успехом применяют в ряде стран в исследовательских и производственных целях. Для выращивания вируса ящура первоначально применяли первичную культуру клеток почек телят, выращенную в 1-литровых вращающихся флаконах. Это дало возможность увеличить урожай клеток в 3—3,5 раза по сравнению со статическими культурами в 1—1,5-литровых матрасах. Одновременно возрасли титр вируса, активность комплементсвязывающего антигена и иммуногенность инактивированной вакцины [1555].
В дальнейшем для получения вируса ящура указанным способом широко использовали клетки ВНК-21, выращенные во вращающихся флаконах. Успех во многом зависел от модификации питательной среды. Густые культуры клеток удалось вырастить без смены среды [294]. Введение трисбуфера в период роста культуры обеспечило стабильность pH среды. Высокоочищенные аминокислоты, содержащиеся в среде Игла, были заменены гидролизатом лактальбумина с добавлением гистидина. К этой среде добавляли 10% триптозофосфатного бульона (Дифко) и 10% сыворотки крупного рогатого скота (табл. 10).
Выращивание клеток. Из 7-дневных культур удаляли среду и в каждый сосуд вносили по 20 мл 0,25%-ного раствора трипсина на фосфатнобуферном растворе (pH 7,5).
В период отделения клеток от стекла сосуды вращали при комнатной температуре в течение 20 мин. Клетки ресуспендировали в питательной среде таким образом, чтобы их концентрация в 1 мл приблизительно равнялась 3x105. Полученную суспензию вносили по 100 мл в 2-литровые сосуды. Клеток, выросших в одном сосуде, было достаточно для засева 20 сосудов. В течение первых двух часов для обеспечения равномерного распределения и прикрепления клеток к поверхности стекла сосуды вращали со скоростью 3 об/мин, а в течение последующих семи дней — при 2 об/ч. Посев 30—40x106 клеток в один сосуд позволял получать через шесть дней 50—75х107-клеток жизнеспособностью выше 95%.
Выращивание вируса. Одновременно заражали 2000 флаконов с 6-дневной культурой. В каждый сосуд вносили по 40 мл вируссодержащей ростовой среды (0,01- 0,05 БОЕ на 1 клетку) с 1,5% сыворотки и инкубировали при 37°С в течение 24 ч при постоянном вращении (2 об/ч). Вирус ящура накапливался в титре около 5x108 БОЕ/мл, а выход его составлял 30—50 БОЕ на 1 клетку [299].
В Италии клетки ВНК-21 предварительно выращивали (в течение 48 ч) в перемешиваемой суспензии в реакторе (емкостью 50 л), разбавляли питательной средой и высевали в 1 -литровые вращающиеся флаконы. В зависимости от посеянной дозы клеток культуры выращивали 3—5 дней. В каждый флакон (около 2,5x108 клеток) вносили 70 мл среды ГЛА с вирусом ящура (0,05 ТЦД50 на клетку). Вирусную суспензию собирали через 20—24 ч при достижении максимального титра (107'5-108'5 ЛД50/мл). В 1968 г. для изготовления инактивированной вакцины против ящура было использовано 832 170 флаконов с однослойной культу-
Таблица 10. Среда для выращивания клеток ВНК-21 и вируса во вращающихся культурах
рой клеток ВНК-21. В течение более 20 лет на промышленных роллерных установках Италии выпущены миллиарды доз вакцин против ящура, инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота, парагриппа-3 и болезни Ауески [143]. Вращающиеся культуры различных клеток также широко использовали для производственного выращивания вирусов герпеса, бешенства, кори, осповакцины, краснухи и др.
Для приготовления инактивированной вакцины против восточного энцефаломиелита лошадей был разработан метод выращивания вируса в однослойной первичной культуре клеток куриных эмбрионов во вращающихся флаконах. В каждый флакон с полезной площадью 840 см2 вносили 170 мл среды Игла, 1% глютамина и 10% сыворотки телят и 4—106 клеток/мл трипсинизированных тканей 9-дневных куриных эмбрионов. Сплошной слой клеток формировался через 18-24 ч выращивания при 35°С. В этот период производили смену среды и заражение вирусом. Во флаконы с культурой вносили по 300 мл среды с 0,25 % сывороточного альбумина и 0,005 — ДД50 вируса на клетку. Через 18—24 ч выращивания при 35°С концентрация вируса была максимальной и нередко достигала 10ю ЛД50/мл. Приготовленная из этого вируса формолвакцина обладала высокой иммуногенностью [515].
В статической однослойной культуре постоянной линии клеток РК-15 вирус классической чумы свиней накапливался в титре 6,3 lg ТЦД^/мл, тогда как в культуре на микроносителе он достигал 9,0 lg ТЦЦ50/мл [434].
Аттенуированный штамм вируса трансмиссивного гастроэнтерита свиней размножали в роллерной культуре постоянной линии клеток почки эмбриона свиньи (линия СПЭВ). Для выращивания вируса использовали культуры, образовавшие монослой клеток через 40—48 ч. Вирус перед заражением обрабатывали трипсином (5 мкг/мл, при 37°С, в течение 30 мин) и вносили в культуру из расчета 10 ТЦД50 на 1 клетку. Инфицированные культуры инкубировали при 37°С в течение 16—20 ч и замораживали при — 20°С. При серийном пассировании в указанных условиях вирус регулярно накапливался в титре 108— 109 ТЦД50/мл. Аналогичная методика, примененная ранее для культивирования ротавируса свиней, а затем и респираторного коронавируса свиней, позволила получить культуральные препараты этих вирусов с высоким титром.
Ротавирус крупного рогатого скота серийно размножали в постоянной линии клеток свиньи (линия СПЭВ) в присутствии трипсина. Размножение его сопровождалось слабым ЦПЭ. Репродукция вируса была больше выражена в роллерной культуре, чем в статической.
Для производства вакцины против болезни Марека используют фиброблас- ты эмбрионов кур или перепелов, которые обычно культивируют в круглостенных сосудах на роллерных установках.
Приведенные данные свидетельствуют о высокой эффективности метода вращающейся культуры клеток в приготовлении вирусных биопрепаратов. Большим шагом вперед в технологии выращивания однослойных культур стала разработка таких аппаратов как многопластинчатые или многотрубчатые культиваторы, применение которых обеспечило одновременное выращивание большого количества клеток на твердом субстрате в одном культуральном сосуде (рис. 14). В однослойной культуре, выращенной в многопластинчатом культиваторе, вирусы гриппа и другие накапливались в таком же титре, как и в однослойной ста-
Рис. 14. Схематическое изображение многопластинчатых (1 - 5) и многотрубчатых (6 и 7) культиваторов клеток.
1, 2, 3 — статистические культиваторы; 4—7— динамические культиваторы;
4 — вращающиеся пластины внутри культиватора; 5— 7 — вращается весь культиватор; Р - резервуар со средой; Н- перекачивающий насос.
тической культуре в матрасах Ру. После образования монослоя в культиватор вносили поддерживающую среду с вирусом. При инкубировании проводили медленное перемешивание и аэрацию поддерживающей среды. Культуральную жидкость собирали в период максимального накопления вируса. Во время выращивания вируса обработанную газовую смесь обеззараживали с помощью специальной установки. Разработанные культиваторы с титановыми пластинами с успехом заменили вращающиеся бутыли при производстве вакцин против эпидемического паротита (свинки), кори и краснухи.
Для производственного выращивания клеток и вирусов были предложены многотрубчатые культиваторы, представляющие собой цилиндрический горизонтально расположенный сосуд из нержавеющей стали, заполненный массой стеклянных трубок, расположенных параллельно продольной оси культиватора. Последний устанавливается на специальной механизированной подставке в термостатированном помещении. В рабочем положении цилиндрический культиватор медленно вращается вокруг продольной оси.
Однослойные культуры клеток, выращенные в многотрубчатом культиваторе [1368], оказались весьма эффективными для получения различных вирусов в больших количествах (табл. 11). В качестве прототипа ниже приведено схематическое описание выращивания вируса в культуре клеток во вращающейся колонне.
Клетки трипсинизированной ткани куриного эмбриона суспендируют в питательной среде Игла, содержащей сыворотку крупного рогатого скота. Культуральный аппарат ставят в вертикальное положение таким образом, чтобы ввод находился на нижней распределительной пластинке. Воздушный фильтр остав-
Таблица 11. Продукция вируса в однослойных культурах, выращенных в стационарных флаконах и в многотрубчатом культиваторе «вращающаяся колонна» [1368]
ляют открытым. В культуральные сосуды (стеклянные трубки) на 1 см2 поверхности вносят по 0,2 мл питательной среды и 5х104 клеток. Стеклянные трубки заполняют на 1/5, что обеспечивает благоприятное соотношение газа и жидкости (4:1). После этого аппарат с суспензией клеток быстро переворачивают в горизонтальное положение и вращают вокруг продольной оси со скоростью 5 об/ч. При такой угловой скорости клетки равномерно распределяются на поверхности сосуда. Выращивание клеток длится 4—5 дней при температуре 37°С. При этом образуется монослойная культура, которую можно видеть при микроскопическом исследовании. После формирования сплошного слоя культуральное устройство вновь ставят в вертикальное положение и удаляют ростовую питательную среду, а культуру промывают изотоническим солевым раствором.
Вирус ньюкаслской болезни в среде 199 (10 ТЦД50/мл), вносят в культуральный аппарат (приблизительно 0,01 мл на 1 см2 поверхности), возвращают аппарат в горизонтальное положение и вращают 1—3 ч для адсорбции вируса. Затем монослой промывают поддерживающей средой, вносят ее по 0,2 мл на 1 см2 и аппарат с инфицированной культурой инкубируют в течение необходимого времени для максимального размножения вируса.
Внеклеточный вирус получают путем однократного или повторного слива питательной среды из культурального аппарата в приемник, а связанный с клетками — с помощью раствора трипсин-версена. С этой целью культуральный аппарат вращают в течение нескольких минут, чтобы клетки отделились от стенок стеклянных трубок.
Аналогичный трубчатый лабораторный культиватор использовали для выращивания стабильных линий клеток Vero, BS-C-1, IMH-P и первичной культуры клеток куриного эмбриона с целью продукции вирусов кори, краснухи, полио- и герпесвирусов.
Вирусы при изготовлении инактивированной вакцины против болезни Марека выращивали с использованием культиваторов со вставленными в них цилиндрическими стеклянными трубками.
Многодисковые и многотрубчатые культиваторы можно с успехом использовать для массового выращивания различных вирусов на различных клеточных субстратах. С той же целью могут быть применены многолотковые системы фирмы Nunc (Дания) площадью 6000 см2 и батарейные многолотковые системы, объединяющие 40 лотков с общей рабочей поверхностью 24 000 см2. Многолотковые системы можно соединять в любых комбинациях.
Для выращивания вируса краснухи в больших объемах использовали реактор со стеклянными бусами диаметром 3 мм, на которых выращивали клетки Vero. Циркуляция питательной среды (МЕМ с 10% сыворотки эмбрионов коров) обеспечивалась насосом, газовой фазой служил воздух с 5% СС^. При инфицировании вирусом содержание сыворотки в среде снижали до 2%. Вирусную жидкость сливали через каждые 24 ч, заменяя свежей, и хранили при температуре —70°С. Выход вируса составлял 10,0 lg ТЦД50/мл. Титрование вируса по ТЦД50 хорошо коррелировало с определением его концентрации по тесту ИФА.
При изготовлении живых вакцин для ветеринарной практики используют преимущественно однослойные первичные культуры. Такие препараты часто обладают высокой экономичностью (в 1 мл содержится 10—100 и более иммунизирующих доз). Для их производства не требуется больших количеств вирусного материала, вирусы размножают в однослойных статических или роллерных культурах.
В таблице приведены основные культуральные вакцины для людей и животных, испытанные в экспериментальных условиях или применяемые в практике.
В ветеринарной практике ряда стран широко применяют культуральные живые вакцины против чумы плотоядных, чумы свиней, ринотрахеита и диареи крупного рогатого скота, болезни Ауески, ньюкаслской болезни, болезни Марека, катаральной лихорадки овец и ларинготрахеита птиц и др.
Кроме урожая вируса, его антигенности и приживляемости в организме, с клеточным субстратом может быть связана безопасность применения вакцины.
Для широкого применения методов групповой иммунизации животных необходимо значительное увеличение расхода живых вакцин и, соответственно, расширение масштабов их производства. В таком случае, существующие способы размножения вакцинных штаммов следует существенно модернизировать.
Выращивание вируса инфекционной анемии лошадей обычно проводят в культурах лейкоцитов или клеток костного мозга лошади, селезенки эмбриона лошади или постоянной линии клеток кожи лошади (CCL-57), что дает возможность получить антиген, пригодный для диагностики этого заболевания. Продуктивно инфицированные постоянные линии клеток часто используют для получения вируса лейкоза крупного рогатого скота и лейкемии кошек.
С целью повышения активности культуральных антигенов для серологических реакций часто уменьшают объем среды при заражении культур или используют только клетки инфицированных культур в период выраженного цитопати- ческого эффекта, обрабатывая их соответствующим образом.
Культуры клеток на микроносителях (МН) оказались весьма перспективными при производстве вирусных вакцин, а также других продуктов клеточного и вирусного происхождения. Этот метод широко применяют в биологической промышленности многие высокоразвитые страны. Культуры различных клеток на микроносителе оказались достаточно эффективными для выращивания многих опасных вирусов человека и животных.
Этим методом размножают вирус полиомиелита в первичной культуре клеток почки обезьяны и в клетках Vero, вирусы бешенства и кори в первичной культуре клеток почки собаки, вирус краснухи в клетках ВНК-21, ящура в клетках TBRS-2 и ВНК-21, вирус гриппа и Синдбис в клетках МДСК и ВНК-21, вирус простого герпеса в клетках HeLa, MRC-5, \fero и RK-13. Поданным некоторых авторов, выход вируса (на одну клетку) одинаков в культурах клеток, выросших в статических условиях или на микрогранулах. Коллагеновые микросферы активируют клеточную дифференциацию, синтез белков и их секрецию.
При выращивании вирусов в культуре клеток с микроносителем необходимо учитывать способность их к цитолизу. Если вирус быстро разрушает клетки, то
Таблица 12. Культуры клеток, наиболее часто используемые в качестве субстрата при изготовлении вирусных вакцин
заражение следует производить в период максимальной плотности жизнеспособных клеток, если он медленно или совсем не разрушает клетки, то его рекомендуют вносить за несколько суток до этого срока. Метод культивирования клеток на микроносителях применяют при изготовлении ряда вакцин против полиомиелита, краснухи, бешенства, герпеса простого (тип 2), гриппа, ящура. Некоторые из них, например, вакцины против полиомиелита, бешенства, ящу
ра готовили в промышленных масштабах для широкого практического использования. Вакцину против полиомиелита первоначально готовили с использованием первичной культуры клеток почки обезьян, выращенной на микроносителе ДЭАЭ-сефадекса А-50 в культиваторах емкостью 40— 135 л. За 7—8 суток выращивания численность клеточной популяции увеличивалась в 8—10 раз, а концентрация достигала 106 клеток/мл. В таких культурах вирус полиомиелита накапливался в высоком титре (8,1—8,3 lg ТЦД50/мл). Положительные результаты получены при выращивании полиовируса в субкультурах клеток почек обезьян с использованием цитодекса в качестве микроносителя и культиваторов емкостью до 650 л. Проведение 2-3 пассажей клеток почек обезьян экономило дорогостоящее первичное сырье и упрощало технологию выращивания вируса.
В дальнейшем была изыскана возможность замены первичных культур клеток почки обезьян постоянными линиями клеток. Представилась возможность размножения различных типов вируса полиомиелита в трех постоянных линиях клеток почек обезьяны: LLC-MK2, Vero и CV-1, выращенных в культуре на микроносителе. На основе таких вирусов изготовлена инактивированная полио- вакцина. В ферментерах получали культуру клеток с концентрацией 106 клеток/мл. Выход вируса был не ниже, чем в однослойной первичной культуре клеток почек обезьяны, и выше, чем в однослойной статической культуре гомологичных клеток. В дальнейшем было установлено отсутствие вирусной контаминации или туморогенных свойств клеток Vero. Разработан метод культивирования клеток \fero на цитодексе-1 (1,5 г/л) в объеме 1000 л для размножения полиовируса I, II и III типов [1086]. В настоящее время клетки \fero считают наиболее перспективными и экономичными при крупномасштабном производстве полиовакцины вакцины на микроносителях. Для производства инактивированных полиовирусных и других вакцин во Франции клетки на микроносителе выращивали в реакторах емкостью 2000 и 6000 л. При культивировании со сменой среды плотность популяции достигала 2,2x107 клеток/мл [715].
Вирус бешенства для изготовления инактивированной антирабической вакцины выращивали в первичной культуре клеток почки собаки на микроносителе. Поскольку вирус бешенства медленно разрушает клетки, то на одной культуре получали несколько урожаев вируса при замене среды через каждые 4—5 суток. Титр инфекционности указанного вируса составил 6,0+1,0 lg ИД50/мл. При крупномасштабном производстве инактивированной вакцины против бешенства используют постоянную линию клеток Vero, которую размножают на микроносителе в суспензии с использованием возрастающего объема 150—500—1000 л. При заражении вирусом используют среду без сыворотки. Сбор вируса производят многократно через каждые 3—4 дня. Вирус концентрируют, инактивируют бета-пропиолактоном (БПЛ) и очищают.
Вирус ящура выращивали в постоянной линии клеток почки свиньи (IBRS-2) на микроносителе в ферментерах емкостью 150—235 л. Выход клеток был в 3 раза большим, чем в статической культуре во флаконах. Аналогичным образом вирус ящура выращивали в клетках ВНК-21 на микроносителе. Инфекционная и
комплементфиксирующая активность вируса ящура типов А и О была выше при выращивании клеток на микроносителях, чем во вращающихся флаконах. При культивировании вируса ящура в клетках ВНК-21 на микроносителе отмечено повышение выхода клеток и вирусного антигена, а также повышение иммуно- генности инактивированной вакцины. В культуре клеток ВНК-21 (клон 13) на микроносителе выход вируса ящура был выше (9,5 lg ТЦД50/мл), чем в роллер- ной культуре (8,5 lg ТЦД50/мл) [699]. Хорошее накопление вируса краснухи получено в культуре клеток ВНК-21 на микроносителе.
Вирус панлейкопении кошек выращивали в культуре перевиваемых клеток легких эмбриона кошки. Инфицированную культуру инкубировали до полного разрушения клеток на микроносителе под действием вируса. Приготовленная из него инактивированная вакцина обладала выраженной иммуногенностью [1310].
Пролиферативная активность многих клеток (фибробласты куриного эмбриона, клетки яичника китайского хомяка — СНО, клетки почки обезьяны и диплоидные W-1-38) была выше при культивировании на микроносителях, чем в роллерных флаконах. Опыты, проведенные с полиовирусом и вирусом Синд- бис, показали, что выход последнего в расчете на одну клетку куриного эмбриона в роллерной культуре был выше, чем в культуре на микроносителе. Однако титр обоих вирусов во всех культурах клеток на микроносителе неизменно был выше, чем в культурах тех же клеток во вращающихся флаконах. Это связано с большей концентрацией клеток на единицу объема среды в первом случае, чем во втором.
Клетки линии FLK, инфицированные вирусом лейкоза крупного рогатого скота, выращенные на микроносителе, длительно сохраняли жизнеспособность и поддерживали продукцию вирусного антигена [194].
Респираторно-синцитиальный (PC) вирус крупного рогатого скота хорошо размножался в первичной культуре тестикулярной ткани телят на микроносителе (6,0 lg ИД50/мл). В результате периодической смены среды можно получить несколько урожаев вируса. PC-вирус крупного рогатого скота выращивали в культуре перевиваемых клеток слизистой оболочки носа крупного рогатого скота (линия М-57) в однослойной статической культуре и на микроносителе. Урожай клеток в культуре на микроносителе (цитодекс 3; 1,5 г/мл) был в 3 раза выше, чем в однослойной пристеночной культуре. В конечном счете в первом случае культуральная система оказалась значительно продуктивнее и экономичнее для получения вируса, чем во втором. Микроносители были использованы для выращивания клеток насекомых и репродукции арбовирусов.
Технология крупномасштабного производства гликопротеина 160 кД (gp 160) ВПГ-1 разработана с использованием клеток Vero, выращенных на микроносителе в культиваторах емкостью 40 л. Максимальный выход gp 160 наблюдали через 40 ч после заражения клеток (106/мл) рекомбинантным вирусом вакцины. Из одного ферментера после очистки получали 50 мг белка gp 160, обладающего выраженной иммуногенностью [295].
Коронавирус мышей выращивали в культуре клеток мышей (линия ДВТ), используя в качестве микроносителя Цитодекс 1 в концентрации 5 г на 1 л среды L=15 с 5% сыворотки плодов крупного рогатого скота. В течение семи дней культивирования концентрация клеток повышалась примерно в 10 раз (ЗхЮ6 мл). Выход вируса на одну клетку был таким же как и в статической однослойной культуре.
Вирус болезни Ауески размножали в постоянной линии клеток (NLST) тестикулярной ткани свиней, выращенной на микроносителе в реакторе емкостью 500 л. Накопление клеток вируса и его антигена было более высоким в суспензионной, чем в статической однослойной культуре.
При массовом использовании продуктов, полученных с применением производных декстрана (ДЭАЭ-сефадекса А-50, цитодексов), необходимо знать, остаются ли в них какие-то количества ДЭАЭ-декстрана. Масс-спектроскопическими исследованиями не установлено наличие ДЭАЭ-декстрана в суспензии по- лиовируса, выращенного на микроносителе.
Для производства живых и инактивированных вакцин во многих странах налажено крупномасштабное производство однослойных культур.
В 1954—1967 гг. в США произведено около 1000 т вирусной суспензии в однослойной первичной культуре клеток почек обезьян. Ее в основном использовали для приготовления инактивированной вакцины против полиомиелита и в меньшей степени для коревой и аденовирусной вакцин.
С технологической точки зрения при промышленном производстве вирусных вакцин наибольший интерес представляет высокая эффективность выращивания клеток и максимальный выход вируса или вирусного антигена. В случае приготовления первичных культур особое внимание следует уделять состоянию животных — доноров ткани.
Известен ряд критических факторов, которые следует учитывать при производстве культуральных вирусных вакцин на основе первичных культур.
Приготовление однослойных культур — трудоемкий процесс. Большие масштабы производства многих культуральных инактивированных вакцин привели к необходимости совершенствования технологии их приготовления.
Технологическая линия для массового выращивания вируса ящура в первичной однослойной культуре клеток почек телят в матрасах Ру емкостью 1 л, смонтированная в 1958 г. в Италии, позволяла получить в неделю 300—400 л вирусной суспензии с титром 107—107,5. Многие технологические процессы были механизированы и дали возможность повысить производительность метода. Однако масштабы производства вирусного сырья и повышение качества инактивированных вакцин требовали дальнейшего совершенствования аппаратуры и технологии промышленных способов выращивания вирусов.
Важным шагом в усовершенствовании метода однослойных культур явилось выращивание клеток во вращающихся круглостенных сосудах. При этом значительно увеличилось соотношение поверхности культивирования (см2) к объему среды (мл), которое достигало примерно 10. Высокая концентрация клеток (8х 10б клеток ВНК и 2,4х106 клеток почки теленка) на 1 мл поддерживающей среды неизбежно сказалась на повышении активности вирусных антигенов [143]. Благодаря аппаратурно-технологическим разработкам производительность метода выращивания однослойных культур достигала высокого уровня. Все операции, связанные с подготовкой посуды, выращиванием клеток и получением вируса, были механизированы. Вращающиеся литровые сосуды с культурой помещали в цилиндрические проволочные кассеты (по 18 в каждую). Кассеты укладывали на стеллажи с вращающимися вальцами. Одна пятиярусная рол-
лерная установка одновременно вмещала 400 проволочных кассет с 7200 вращающимися сосудами. В институте зоопрофилактики в Брешия (Италия) было смонтировано четыре таких установки на 2800 1-литровых бутылей [143].
До сих пор этот метод с успехом применяют в ряде стран в исследовательских и производственных целях. Для выращивания вируса ящура первоначально применяли первичную культуру клеток почек телят, выращенную в 1-литровых вращающихся флаконах. Это дало возможность увеличить урожай клеток в 3—3,5 раза по сравнению со статическими культурами в 1—1,5-литровых матрасах. Одновременно возрасли титр вируса, активность комплементсвязывающего антигена и иммуногенность инактивированной вакцины [1555].
В дальнейшем для получения вируса ящура указанным способом широко использовали клетки ВНК-21, выращенные во вращающихся флаконах. Успех во многом зависел от модификации питательной среды. Густые культуры клеток удалось вырастить без смены среды [294]. Введение трисбуфера в период роста культуры обеспечило стабильность pH среды. Высокоочищенные аминокислоты, содержащиеся в среде Игла, были заменены гидролизатом лактальбумина с добавлением гистидина. К этой среде добавляли 10% триптозофосфатного бульона (Дифко) и 10% сыворотки крупного рогатого скота (табл. 10).
Выращивание клеток. Из 7-дневных культур удаляли среду и в каждый сосуд вносили по 20 мл 0,25%-ного раствора трипсина на фосфатнобуферном растворе (pH 7,5).
В период отделения клеток от стекла сосуды вращали при комнатной температуре в течение 20 мин. Клетки ресуспендировали в питательной среде таким образом, чтобы их концентрация в 1 мл приблизительно равнялась 3x105. Полученную суспензию вносили по 100 мл в 2-литровые сосуды. Клеток, выросших в одном сосуде, было достаточно для засева 20 сосудов. В течение первых двух часов для обеспечения равномерного распределения и прикрепления клеток к поверхности стекла сосуды вращали со скоростью 3 об/мин, а в течение последующих семи дней — при 2 об/ч. Посев 30—40x106 клеток в один сосуд позволял получать через шесть дней 50—75х107-клеток жизнеспособностью выше 95%.
Выращивание вируса. Одновременно заражали 2000 флаконов с 6-дневной культурой. В каждый сосуд вносили по 40 мл вируссодержащей ростовой среды (0,01- 0,05 БОЕ на 1 клетку) с 1,5% сыворотки и инкубировали при 37°С в течение 24 ч при постоянном вращении (2 об/ч). Вирус ящура накапливался в титре около 5x108 БОЕ/мл, а выход его составлял 30—50 БОЕ на 1 клетку [299].
В Италии клетки ВНК-21 предварительно выращивали (в течение 48 ч) в перемешиваемой суспензии в реакторе (емкостью 50 л), разбавляли питательной средой и высевали в 1 -литровые вращающиеся флаконы. В зависимости от посеянной дозы клеток культуры выращивали 3—5 дней. В каждый флакон (около 2,5x108 клеток) вносили 70 мл среды ГЛА с вирусом ящура (0,05 ТЦД50 на клетку). Вирусную суспензию собирали через 20—24 ч при достижении максимального титра (107'5-108'5 ЛД50/мл). В 1968 г. для изготовления инактивированной вакцины против ящура было использовано 832 170 флаконов с однослойной культу-
Таблица 10. Среда для выращивания клеток ВНК-21 и вируса во вращающихся культурах
|
Компонент |
Концентрация, г/л |
|
NaCl |
6,85 |
|
КС1 |
0,4 |
|
СаС12 |
0,2 |
|
MgS04x7H20 |
0,2 |
|
NaH2P04 х Н20 |
0,12 |
|
Fe(N03)3 х 9Н20 |
0,0001 |
|
глюкоза |
4,5 |
|
1-глютамин |
0,292 |
|
NaHCOj |
0,35 |
|
Трисбуфер (pH 7,5; 0,16 М) |
125 мл |
|
Гидролизат лактальбумина |
5,0 |
|
1- гистидин НС1 |
0,05 |
|
Витамины (необходимые для клеток HeLa) |
0,02 |
|
Феноловый красный (10%-ный) |
0,15 мл |
рой клеток ВНК-21. В течение более 20 лет на промышленных роллерных установках Италии выпущены миллиарды доз вакцин против ящура, инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота, парагриппа-3 и болезни Ауески [143]. Вращающиеся культуры различных клеток также широко использовали для производственного выращивания вирусов герпеса, бешенства, кори, осповакцины, краснухи и др.
Для приготовления инактивированной вакцины против восточного энцефаломиелита лошадей был разработан метод выращивания вируса в однослойной первичной культуре клеток куриных эмбрионов во вращающихся флаконах. В каждый флакон с полезной площадью 840 см2 вносили 170 мл среды Игла, 1% глютамина и 10% сыворотки телят и 4—106 клеток/мл трипсинизированных тканей 9-дневных куриных эмбрионов. Сплошной слой клеток формировался через 18-24 ч выращивания при 35°С. В этот период производили смену среды и заражение вирусом. Во флаконы с культурой вносили по 300 мл среды с 0,25 % сывороточного альбумина и 0,005 — ДД50 вируса на клетку. Через 18—24 ч выращивания при 35°С концентрация вируса была максимальной и нередко достигала 10ю ЛД50/мл. Приготовленная из этого вируса формолвакцина обладала высокой иммуногенностью [515].
В статической однослойной культуре постоянной линии клеток РК-15 вирус классической чумы свиней накапливался в титре 6,3 lg ТЦД^/мл, тогда как в культуре на микроносителе он достигал 9,0 lg ТЦЦ50/мл [434].
Аттенуированный штамм вируса трансмиссивного гастроэнтерита свиней размножали в роллерной культуре постоянной линии клеток почки эмбриона свиньи (линия СПЭВ). Для выращивания вируса использовали культуры, образовавшие монослой клеток через 40—48 ч. Вирус перед заражением обрабатывали трипсином (5 мкг/мл, при 37°С, в течение 30 мин) и вносили в культуру из расчета 10 ТЦД50 на 1 клетку. Инфицированные культуры инкубировали при 37°С в течение 16—20 ч и замораживали при — 20°С. При серийном пассировании в указанных условиях вирус регулярно накапливался в титре 108— 109 ТЦД50/мл. Аналогичная методика, примененная ранее для культивирования ротавируса свиней, а затем и респираторного коронавируса свиней, позволила получить культуральные препараты этих вирусов с высоким титром.
Ротавирус крупного рогатого скота серийно размножали в постоянной линии клеток свиньи (линия СПЭВ) в присутствии трипсина. Размножение его сопровождалось слабым ЦПЭ. Репродукция вируса была больше выражена в роллерной культуре, чем в статической.
Для производства вакцины против болезни Марека используют фиброблас- ты эмбрионов кур или перепелов, которые обычно культивируют в круглостенных сосудах на роллерных установках.
Приведенные данные свидетельствуют о высокой эффективности метода вращающейся культуры клеток в приготовлении вирусных биопрепаратов. Большим шагом вперед в технологии выращивания однослойных культур стала разработка таких аппаратов как многопластинчатые или многотрубчатые культиваторы, применение которых обеспечило одновременное выращивание большого количества клеток на твердом субстрате в одном культуральном сосуде (рис. 14). В однослойной культуре, выращенной в многопластинчатом культиваторе, вирусы гриппа и другие накапливались в таком же титре, как и в однослойной ста-
Рис. 14. Схематическое изображение многопластинчатых (1 - 5) и многотрубчатых (6 и 7) культиваторов клеток.
1, 2, 3 — статистические культиваторы; 4—7— динамические культиваторы;
4 — вращающиеся пластины внутри культиватора; 5— 7 — вращается весь культиватор; Р - резервуар со средой; Н- перекачивающий насос.
тической культуре в матрасах Ру. После образования монослоя в культиватор вносили поддерживающую среду с вирусом. При инкубировании проводили медленное перемешивание и аэрацию поддерживающей среды. Культуральную жидкость собирали в период максимального накопления вируса. Во время выращивания вируса обработанную газовую смесь обеззараживали с помощью специальной установки. Разработанные культиваторы с титановыми пластинами с успехом заменили вращающиеся бутыли при производстве вакцин против эпидемического паротита (свинки), кори и краснухи.
Для производственного выращивания клеток и вирусов были предложены многотрубчатые культиваторы, представляющие собой цилиндрический горизонтально расположенный сосуд из нержавеющей стали, заполненный массой стеклянных трубок, расположенных параллельно продольной оси культиватора. Последний устанавливается на специальной механизированной подставке в термостатированном помещении. В рабочем положении цилиндрический культиватор медленно вращается вокруг продольной оси.
Однослойные культуры клеток, выращенные в многотрубчатом культиваторе [1368], оказались весьма эффективными для получения различных вирусов в больших количествах (табл. 11). В качестве прототипа ниже приведено схематическое описание выращивания вируса в культуре клеток во вращающейся колонне.
Клетки трипсинизированной ткани куриного эмбриона суспендируют в питательной среде Игла, содержащей сыворотку крупного рогатого скота. Культуральный аппарат ставят в вертикальное положение таким образом, чтобы ввод находился на нижней распределительной пластинке. Воздушный фильтр остав-
Таблица 11. Продукция вируса в однослойных культурах, выращенных в стационарных флаконах и в многотрубчатом культиваторе «вращающаяся колонна» [1368]
|
Вирус |
Культура клеток |
Способ выращивания |
Средний титр (lg) |
|
Ящура, тип С |
первичная, клетки почки свиньи |
Вращающаяся колонна |
7,42 ТЦД50/мл |
|
Стационарные флаконы |
7,34 ТЦД50/мл |
||
|
То же |
линия клеток ВНК-21 |
Вращающаяся колонна |
7,61 ТЦД50/мл |
|
Стационарные флаконы |
7,50 ТЦД50/мл |
||
|
Болезни Ауески |
первичная, клетки куриного эмбриона |
Вращающаяся колонна |
7,20 ТЦД50/мл |
|
Стационарные флаконы |
7,15 ТЦД50/мл |
||
|
Ньюкаслской болезни (штамм Ла-Сота) |
То же |
Вращающаяся колонна |
7,95 ЭЛД60/мл |
|
Стационарные флаконы |
7,72 ЭЛД60/мл |
||
|
Гриппа (Гонконг А2) |
То же |
Вращающаяся колонна |
8,50 ЭЛД60/мл |
|
Стационарные флаконы |
8,00 ЭЛД60/мл |
ляют открытым. В культуральные сосуды (стеклянные трубки) на 1 см2 поверхности вносят по 0,2 мл питательной среды и 5х104 клеток. Стеклянные трубки заполняют на 1/5, что обеспечивает благоприятное соотношение газа и жидкости (4:1). После этого аппарат с суспензией клеток быстро переворачивают в горизонтальное положение и вращают вокруг продольной оси со скоростью 5 об/ч. При такой угловой скорости клетки равномерно распределяются на поверхности сосуда. Выращивание клеток длится 4—5 дней при температуре 37°С. При этом образуется монослойная культура, которую можно видеть при микроскопическом исследовании. После формирования сплошного слоя культуральное устройство вновь ставят в вертикальное положение и удаляют ростовую питательную среду, а культуру промывают изотоническим солевым раствором.
Вирус ньюкаслской болезни в среде 199 (10 ТЦД50/мл), вносят в культуральный аппарат (приблизительно 0,01 мл на 1 см2 поверхности), возвращают аппарат в горизонтальное положение и вращают 1—3 ч для адсорбции вируса. Затем монослой промывают поддерживающей средой, вносят ее по 0,2 мл на 1 см2 и аппарат с инфицированной культурой инкубируют в течение необходимого времени для максимального размножения вируса.
Внеклеточный вирус получают путем однократного или повторного слива питательной среды из культурального аппарата в приемник, а связанный с клетками — с помощью раствора трипсин-версена. С этой целью культуральный аппарат вращают в течение нескольких минут, чтобы клетки отделились от стенок стеклянных трубок.
Аналогичный трубчатый лабораторный культиватор использовали для выращивания стабильных линий клеток Vero, BS-C-1, IMH-P и первичной культуры клеток куриного эмбриона с целью продукции вирусов кори, краснухи, полио- и герпесвирусов.
Вирусы при изготовлении инактивированной вакцины против болезни Марека выращивали с использованием культиваторов со вставленными в них цилиндрическими стеклянными трубками.
Многодисковые и многотрубчатые культиваторы можно с успехом использовать для массового выращивания различных вирусов на различных клеточных субстратах. С той же целью могут быть применены многолотковые системы фирмы Nunc (Дания) площадью 6000 см2 и батарейные многолотковые системы, объединяющие 40 лотков с общей рабочей поверхностью 24 000 см2. Многолотковые системы можно соединять в любых комбинациях.
Для выращивания вируса краснухи в больших объемах использовали реактор со стеклянными бусами диаметром 3 мм, на которых выращивали клетки Vero. Циркуляция питательной среды (МЕМ с 10% сыворотки эмбрионов коров) обеспечивалась насосом, газовой фазой служил воздух с 5% СС^. При инфицировании вирусом содержание сыворотки в среде снижали до 2%. Вирусную жидкость сливали через каждые 24 ч, заменяя свежей, и хранили при температуре —70°С. Выход вируса составлял 10,0 lg ТЦД50/мл. Титрование вируса по ТЦД50 хорошо коррелировало с определением его концентрации по тесту ИФА.
При изготовлении живых вакцин для ветеринарной практики используют преимущественно однослойные первичные культуры. Такие препараты часто обладают высокой экономичностью (в 1 мл содержится 10—100 и более иммунизирующих доз). Для их производства не требуется больших количеств вирусного материала, вирусы размножают в однослойных статических или роллерных культурах.
В таблице приведены основные культуральные вакцины для людей и животных, испытанные в экспериментальных условиях или применяемые в практике.
В ветеринарной практике ряда стран широко применяют культуральные живые вакцины против чумы плотоядных, чумы свиней, ринотрахеита и диареи крупного рогатого скота, болезни Ауески, ньюкаслской болезни, болезни Марека, катаральной лихорадки овец и ларинготрахеита птиц и др.
Кроме урожая вируса, его антигенности и приживляемости в организме, с клеточным субстратом может быть связана безопасность применения вакцины.
Для широкого применения методов групповой иммунизации животных необходимо значительное увеличение расхода живых вакцин и, соответственно, расширение масштабов их производства. В таком случае, существующие способы размножения вакцинных штаммов следует существенно модернизировать.
Выращивание вируса инфекционной анемии лошадей обычно проводят в культурах лейкоцитов или клеток костного мозга лошади, селезенки эмбриона лошади или постоянной линии клеток кожи лошади (CCL-57), что дает возможность получить антиген, пригодный для диагностики этого заболевания. Продуктивно инфицированные постоянные линии клеток часто используют для получения вируса лейкоза крупного рогатого скота и лейкемии кошек.
С целью повышения активности культуральных антигенов для серологических реакций часто уменьшают объем среды при заражении культур или используют только клетки инфицированных культур в период выраженного цитопати- ческого эффекта, обрабатывая их соответствующим образом.
Культуры клеток на микроносителях (МН) оказались весьма перспективными при производстве вирусных вакцин, а также других продуктов клеточного и вирусного происхождения. Этот метод широко применяют в биологической промышленности многие высокоразвитые страны. Культуры различных клеток на микроносителе оказались достаточно эффективными для выращивания многих опасных вирусов человека и животных.
Этим методом размножают вирус полиомиелита в первичной культуре клеток почки обезьяны и в клетках Vero, вирусы бешенства и кори в первичной культуре клеток почки собаки, вирус краснухи в клетках ВНК-21, ящура в клетках TBRS-2 и ВНК-21, вирус гриппа и Синдбис в клетках МДСК и ВНК-21, вирус простого герпеса в клетках HeLa, MRC-5, \fero и RK-13. Поданным некоторых авторов, выход вируса (на одну клетку) одинаков в культурах клеток, выросших в статических условиях или на микрогранулах. Коллагеновые микросферы активируют клеточную дифференциацию, синтез белков и их секрецию.
При выращивании вирусов в культуре клеток с микроносителем необходимо учитывать способность их к цитолизу. Если вирус быстро разрушает клетки, то
Таблица 12. Культуры клеток, наиболее часто используемые в качестве субстрата при изготовлении вирусных вакцин
|
Культуры клеток |
Вакцины |
|
|
Живые |
Инактивированные |
|
|
Куриный эмбрион |
бешенство, корь, ньюкаслская болезнь, болезнь Ауески, энцефаломиелит лошадей, чума плотоядных, болезнь Марека, чума уток |
Корь, клещевой энцефалит, болезнь Ауески, энцефаломиелиты лошадей, японский энцефалит |
|
Почка обезьяны |
Полиомиелит |
Полиомиелит |
|
Почка свиньи |
Бешенство, классическая чума свиней, болезнь Тешена, ньюкаслская болезнь |
Ящур, болезнь Тешена, бешенство |
|
Почка эмбриона свиньи |
Классическая чума свиней |
|
|
Почка крупного рогатого скота |
Чума, ринотрахеит и диарея крупного рогатого скота |
Ящур |
|
Почка овцы |
Катаральная лихорадка овец |
Катаральная лихорадка овец |
|
Кожа эмбриона ОВЦЫ |
Контагиозная эктима овец |
|
|
Тестикулы ягнят |
Классическая чума свиней |
|
|
Почка собаки |
Корь, паротит, гепатит собак, чума плотоядных |
|
|
Почка кролика |
Миксома кроликов |
Болезнь Ауески |
|
Почка морской свинки |
Классическая чума свиней |
|
|
Почка хомяка |
Бешенство, японский энцефалит |
Японский энцефалит |
|
Эмбрион утки |
Краснуха, бешенство |
Бешенство |
|
Линии диплоидных клеток человека |
Полиомиелит, аденовирус-4, корь, краснуха |
Полиомиелит, аденови- рус-4, корь, краснуха |
|
Постоянные линии клеток |
Чума плотоядных, бешенство, трансмиссивный гастроэнтерит свиней, ротавирусная болезнь свиней |
Ящур, африканская чума лошадей, болезнь Ауески, катаральная лихорадка овец, парвовирусная болезнь свиней, бешенство, болезнь Тешена, полиомиелит и др. |
заражение следует производить в период максимальной плотности жизнеспособных клеток, если он медленно или совсем не разрушает клетки, то его рекомендуют вносить за несколько суток до этого срока. Метод культивирования клеток на микроносителях применяют при изготовлении ряда вакцин против полиомиелита, краснухи, бешенства, герпеса простого (тип 2), гриппа, ящура. Некоторые из них, например, вакцины против полиомиелита, бешенства, ящу
ра готовили в промышленных масштабах для широкого практического использования. Вакцину против полиомиелита первоначально готовили с использованием первичной культуры клеток почки обезьян, выращенной на микроносителе ДЭАЭ-сефадекса А-50 в культиваторах емкостью 40— 135 л. За 7—8 суток выращивания численность клеточной популяции увеличивалась в 8—10 раз, а концентрация достигала 106 клеток/мл. В таких культурах вирус полиомиелита накапливался в высоком титре (8,1—8,3 lg ТЦД50/мл). Положительные результаты получены при выращивании полиовируса в субкультурах клеток почек обезьян с использованием цитодекса в качестве микроносителя и культиваторов емкостью до 650 л. Проведение 2-3 пассажей клеток почек обезьян экономило дорогостоящее первичное сырье и упрощало технологию выращивания вируса.
В дальнейшем была изыскана возможность замены первичных культур клеток почки обезьян постоянными линиями клеток. Представилась возможность размножения различных типов вируса полиомиелита в трех постоянных линиях клеток почек обезьяны: LLC-MK2, Vero и CV-1, выращенных в культуре на микроносителе. На основе таких вирусов изготовлена инактивированная полио- вакцина. В ферментерах получали культуру клеток с концентрацией 106 клеток/мл. Выход вируса был не ниже, чем в однослойной первичной культуре клеток почек обезьяны, и выше, чем в однослойной статической культуре гомологичных клеток. В дальнейшем было установлено отсутствие вирусной контаминации или туморогенных свойств клеток Vero. Разработан метод культивирования клеток \fero на цитодексе-1 (1,5 г/л) в объеме 1000 л для размножения полиовируса I, II и III типов [1086]. В настоящее время клетки \fero считают наиболее перспективными и экономичными при крупномасштабном производстве полиовакцины вакцины на микроносителях. Для производства инактивированных полиовирусных и других вакцин во Франции клетки на микроносителе выращивали в реакторах емкостью 2000 и 6000 л. При культивировании со сменой среды плотность популяции достигала 2,2x107 клеток/мл [715].
Вирус бешенства для изготовления инактивированной антирабической вакцины выращивали в первичной культуре клеток почки собаки на микроносителе. Поскольку вирус бешенства медленно разрушает клетки, то на одной культуре получали несколько урожаев вируса при замене среды через каждые 4—5 суток. Титр инфекционности указанного вируса составил 6,0+1,0 lg ИД50/мл. При крупномасштабном производстве инактивированной вакцины против бешенства используют постоянную линию клеток Vero, которую размножают на микроносителе в суспензии с использованием возрастающего объема 150—500—1000 л. При заражении вирусом используют среду без сыворотки. Сбор вируса производят многократно через каждые 3—4 дня. Вирус концентрируют, инактивируют бета-пропиолактоном (БПЛ) и очищают.
Вирус ящура выращивали в постоянной линии клеток почки свиньи (IBRS-2) на микроносителе в ферментерах емкостью 150—235 л. Выход клеток был в 3 раза большим, чем в статической культуре во флаконах. Аналогичным образом вирус ящура выращивали в клетках ВНК-21 на микроносителе. Инфекционная и
комплементфиксирующая активность вируса ящура типов А и О была выше при выращивании клеток на микроносителях, чем во вращающихся флаконах. При культивировании вируса ящура в клетках ВНК-21 на микроносителе отмечено повышение выхода клеток и вирусного антигена, а также повышение иммуно- генности инактивированной вакцины. В культуре клеток ВНК-21 (клон 13) на микроносителе выход вируса ящура был выше (9,5 lg ТЦД50/мл), чем в роллер- ной культуре (8,5 lg ТЦД50/мл) [699]. Хорошее накопление вируса краснухи получено в культуре клеток ВНК-21 на микроносителе.
Вирус панлейкопении кошек выращивали в культуре перевиваемых клеток легких эмбриона кошки. Инфицированную культуру инкубировали до полного разрушения клеток на микроносителе под действием вируса. Приготовленная из него инактивированная вакцина обладала выраженной иммуногенностью [1310].
Пролиферативная активность многих клеток (фибробласты куриного эмбриона, клетки яичника китайского хомяка — СНО, клетки почки обезьяны и диплоидные W-1-38) была выше при культивировании на микроносителях, чем в роллерных флаконах. Опыты, проведенные с полиовирусом и вирусом Синд- бис, показали, что выход последнего в расчете на одну клетку куриного эмбриона в роллерной культуре был выше, чем в культуре на микроносителе. Однако титр обоих вирусов во всех культурах клеток на микроносителе неизменно был выше, чем в культурах тех же клеток во вращающихся флаконах. Это связано с большей концентрацией клеток на единицу объема среды в первом случае, чем во втором.
Клетки линии FLK, инфицированные вирусом лейкоза крупного рогатого скота, выращенные на микроносителе, длительно сохраняли жизнеспособность и поддерживали продукцию вирусного антигена [194].
Респираторно-синцитиальный (PC) вирус крупного рогатого скота хорошо размножался в первичной культуре тестикулярной ткани телят на микроносителе (6,0 lg ИД50/мл). В результате периодической смены среды можно получить несколько урожаев вируса. PC-вирус крупного рогатого скота выращивали в культуре перевиваемых клеток слизистой оболочки носа крупного рогатого скота (линия М-57) в однослойной статической культуре и на микроносителе. Урожай клеток в культуре на микроносителе (цитодекс 3; 1,5 г/мл) был в 3 раза выше, чем в однослойной пристеночной культуре. В конечном счете в первом случае культуральная система оказалась значительно продуктивнее и экономичнее для получения вируса, чем во втором. Микроносители были использованы для выращивания клеток насекомых и репродукции арбовирусов.
Технология крупномасштабного производства гликопротеина 160 кД (gp 160) ВПГ-1 разработана с использованием клеток Vero, выращенных на микроносителе в культиваторах емкостью 40 л. Максимальный выход gp 160 наблюдали через 40 ч после заражения клеток (106/мл) рекомбинантным вирусом вакцины. Из одного ферментера после очистки получали 50 мг белка gp 160, обладающего выраженной иммуногенностью [295].
Коронавирус мышей выращивали в культуре клеток мышей (линия ДВТ), используя в качестве микроносителя Цитодекс 1 в концентрации 5 г на 1 л среды L=15 с 5% сыворотки плодов крупного рогатого скота. В течение семи дней культивирования концентрация клеток повышалась примерно в 10 раз (ЗхЮ6 мл). Выход вируса на одну клетку был таким же как и в статической однослойной культуре.
Вирус болезни Ауески размножали в постоянной линии клеток (NLST) тестикулярной ткани свиней, выращенной на микроносителе в реакторе емкостью 500 л. Накопление клеток вируса и его антигена было более высоким в суспензионной, чем в статической однослойной культуре.
При массовом использовании продуктов, полученных с применением производных декстрана (ДЭАЭ-сефадекса А-50, цитодексов), необходимо знать, остаются ли в них какие-то количества ДЭАЭ-декстрана. Масс-спектроскопическими исследованиями не установлено наличие ДЭАЭ-декстрана в суспензии по- лиовируса, выращенного на микроносителе.