MED24INfO

Большинство живых вирусных вакцин, применяемых сегодня, получены эмпирически серийными пассажами в гетерологичном организме или культуре клеток естественного или гетерологичного хозяина. Адаптация вируса к более интенсивному размножению в необычных условиях сопровождается прогрессирующим снижением и потерей вирулентности для естественного хозяина.
Серийные пассажи в гетерологичном хозяине были классическим способом эмпирической аттенуации вируса. Например, вирусы чумы крупного рогатого скота и классической чумы свиней были аттенуированы и использованы в качестве соответствующих живых вакцин после длительного серийного пассирования в организме кролика. Значительно раньше таким способом получен аттенуированный вирус бешенства. Аттенуированные штаммы многих вирусов получены серийным пассированием в эмбрионах птиц [1130].
В процессе многочисленных пассажей в неестественном хозяине или культуре клеток исходный вирулентный штамм вируса может накопить множество точечных мутаций в геноме, которые лежат в основе аттенуации. Однако, несмотря на многие весьма ценные практические результаты, аттенуация вирусов путем пассирования в системе неестественного хозяина — в целом процесс неуправляемый, а результаты его непредсказуемы.
Получение удовлетворительных аттенуированных мутантов является результатом «генетической рулетки» вследствие случайной селекции мутантов с желаемой степенью аттенуации и выраженной иммуногенностью. Это положение, в частности, подтверждается неудачными результатами повторного получения вакцинного штамма 17Д вируса желтой лихорадки [1131]. Генетическая основа аттенуации вакцинных вирусов кори, паротита, краснухи, желтой лихорадки, ротавируса и осповакцины не известна, тогда как генетические детерминанты аттенуации двух из трех вакцинных штаммов полиовируса достаточно изучены [1130, 1135].

Живые вакцины против чумы КРС (ЧКРС) являются одними из наиболее безопасных и эффективных вирусных вакцин. Вирус ЧКРС аттенуирован разными способами и практически с одинаковым результатом. Три типа аттенуированных вакцин использовали десятилетиями для ликвидации ЧКРС: лапинизиро- ванную, капринизированную и культуральную. Капринизированная вакцина была первой живой вакциной против ЧКРС и использовалась до недавнего времени в Индии. Лапинизированный штамм (Накамура-Ш) адаптировали к культуре клеток почки телят [122] или куриным эмбрионам [1144]. Лапинизирован- но-авинизированную (LA) вакцину в основном применяли в Азии. В странах стационарно неблагополучных по ЧКРС в основном применяли культуральную вакцину RBOK из штамма Kabete «О», который не передается при контакте и создает напряженный иммунитет длительностью не менее 10 лет [1252]. Культуральные вакцины из других штаммов, в том числе созданных в СССР [122, 77], обладали аналогичными свойствами [86].
Несмотря на достигнутые успехи в получении аттенуированных вирусных вакцин эмпирическим путем, на современном этапе происходит замена «генетической рулетки» рациональным констуированием генно-инженерных вакцин. В последнем случае, мутации, связанные с аттенуацией, известны, стабильны и предсказуемы.
Аттенуация вирусов посредством длительного пассирования в клеточных культурах в настоящее время является основным методом получения живых вирусных вакцин. Этот метод основан на селекции пассажных мутантов, отличающихся биологическими свойствами от исходных вирулентных штаммов. Полученные таким образом аттенуированные иммуногенные штаммы аккумулируют в себе множество спонтанных мутаций, что гарантирует им генетическую и фенотипическую стабильность, хотя генетическая основа аттенуации используемых живых вирусных вакцин в большинстве случаев остается невыясненной.
Идентификация вирусных генов, определяющих вирулентность, представляет огромный интерес для получения авирулентных вакцинных штаммов, а также их использования в качестве носителей чужеродных генов. Поэтому изучению молекулярных основ аттенуации вирусов уделяется большое внимание. Наиболее часто с этой целью сопоставляют первичную структуру геномов вирулентных и аттенуированных штаммов [343] и реже прибегают к изучению влияния инактивации или делетирования различных генов на вирулентные свойства вирусов [859].
Молекулярные основы аттенуации наиболее подробно были изучены у вакцинных штаммов трех серотипов вируса полиомиелита, полученных А. Сэби- ным и широко применяемых для пероральной иммунизации людей. Были сделаны попытки выяснить, какие изменения генома привели к аттенуации — потере нейровирулентности вируса.
Около 50 лет тому назад А. Сэбин отметил, что штаммы полиовируса, выделенные от здоровых людей, обладают пониженной нейровирулентностью. Примерно 1 /5 этих штаммов являются высоко аттенуироваными.

Живая оральная вакцина против полиомиелита представляет собой три аттенуированных штамма. Вакцинные штаммы 1 и 3 типа получены пассажами в клеточных культурах различного происхождения. Вакцинный штамм типа 2 получен из природно аттенуированного изолята полиовируса [1130].
Аттенуацию полиовируса типа 3, выделенного от пациента, погибшего от паралитического полиомиелита, проводили следующим образом [670].
21 пассаж на обезьянах (внутрицеребрально);
8 пассажей в культуре тестикулярных клеток обезьян;

39. пассажей в культуре клеток почки обезьян;

3 пассажа методом бляшек в культуре клеток почки обезьян;
3 препаративных пассажа в культуре клеток почки обезьян.
Каждый из трех аттенуированных серотипов вируса содержал различные точечные мутации в 5'-некодирующей области генома, которые могли нарушить трансляцию мРНК. Мутации в капсидных белках, по-видимому, влияли на сборку вирионов.
Сиквенс-анализ исходного родительского полиовируса типа 1 и его вакцинного деривата показал, что у последнего содержится 55 мутаций, приводящих к замене 2i аминокислоты [1285]. 12 аминокислот заменены в структурных белках и 9 — в неструктурных, В кодирующей области на 3'-конце генома были обнаружены две точечные мутации, а в кодирующей области 5'-конца — пять [40]. Для аттенуации полиовируса типа 1 существенной являлась замена аденина на гуанин в позиции 480 в 5'-концевой некодирующей области генома [1013]. Обращает на себя внимание то обстоятельство, что 33% всех аминокислотных замен (7 из 21) приходилось на VP1, ген которого составляет 12% вирусного генома. Концентрация мутационных изменений в наружном белке вируса наводит на мысль, что аттенуация — результат изменений его поверхностных свойств. Однако многочисленность изменений в геноме вакцинных штаммов полиовируса осложняет идентификацию сайта, отвечающего за аттенуацию нейровирулентности. Возможно, что мутации других вирусных генов могли быть также вовлечены в аттенуацию вирулентности вируса для человека [1131]. Анализ рекомбинантов показал, что в определении нейровирулентности полиовируса главная роль принадлежит той половине генома, которая примыкает к 5'-концу и кодирует, в основном, структурные белки, однако участок генома, кодирующий неструктурные белки, тоже может оказывать влияние на нейровирулентность [40]. Оправдалось мнение, что молекулярная основа аттенуации вакцинного штамма полиовируса типа-3 может отличаться от таковой вакцинного штамма полиовируса типа 1. В геноме вакцинного штамма типа 3 выявлено 10 точечных мутаций, которые привели к замене трех аминокислот (по одной в полипетидах VP3, VP1 и протеиназе-2А).
В некодирующей области генома обнаружены две точечные мутации. Из десяти мутаций лишь две имеют отношение к потере нейровирулентности. Одна находится в нуклеотиде-472 в 5'-концевой некодирующей области и легко ре
версирует в организме человека. Другая мутация заключается в замене фенилаланина на серин в позиции 3091 белка VP3. Поскольку она определяет термочувствительность вируса, то с ее потерей восстанавливалась нейровирулентность [996]. Реверсия нейровирулентности аттенуированного полиовируса типа 3 сопровождалась восстановлением одной последовательности в 5'-концевой некодирующей области генома. Эта область является высококонсервативной у трех серотипов полиовируса (74% гомологии) и аналогична по структуре другим пи- корнавирусам. Ее первичная структура определяет вторичную структуру генома этих вирусов и отвечает за сборку и морфогенез вирионов [40]. Поскольку иммунизация аттенуированными вакцинными штаммами полиовируса сопровождается виремией, было высказано предположение, что ограничение репликации в нейронах представляет собой основу их аттенуации у человека [343, 1131].
Ряд исследователей придерживаются мнения, что VP1 является основным сайтом аттенуации полиовируса типа 1. Оно основывается на важной роли VP1 в детерминировании клеточного тропизма и инфекционности вируса. Это наводит на мысль, что изменения в протеине VP1 вакцинного штамма, прежде всего, нарушает его адсорбцию на клетках органов-мишеней, то есть центральной нервной системы [1131].
Мутации, отвечающие за аттенуацию вакцинного штамма полиовируса ти- па-3, также, возможно, связаны с областью, VP1, несмотря на то что, разница между родительским и вакцинным, вирусом заключалась лишь в замене одной аминокислоты (лиз 274 -gt; арг) и не рассматривалась как значимая в структурном отношении. У вакцинированных трехвалентной полиовакциной может иметь место межтиповая рекомбинация вакцинных вирусов с сохранением определенной степени аттенуации у рекомбинантов [996].
При полиомиелите имеются две эффективные вакцины: инактивированная вакцина Солка для внутримышечного применения и живая аттенуированная вакцина Сэбина для орального применения. Эти вакцины явились основой для
разработки программы глобального искоренения полиомиелита. Живая вакцина получила универсальное применение и доказала свою высокую эффективность, несмотря на имевшие место одиночные случаи реверсии вакцинных штаммов. Так, например, полиовирус типа 3 (рЗ/119), выделенный от вакцинированного пациента с признаками полиомиелита, при сиквенс-анализе генома оказался истинным ревертантом вакцинного штамма РЗ Сэбина [670], а случаи полиомиелита в Испании связаны с реверсией вакцинного штамма полиовируса Р1 [882].

Первая живая аттенуированная вакцина против кори получена из исходного вирулентного штамма Эдмонстон, выделенного в 1954 г. и прошедшего 7 пассажей в культуре клеток почки человека и 6 пассажей в культуре клеток Vero. После 24 пассажей в культуре клеток почки и 28 пассажей в культуре клеток амниона человека получен штамм Эдмонстон-Эндерс. В дальнейшем его аттенуировали следующим образом:
6 пассажей на куриных эмбрионах (в амниотическую полость);
13 пассажей в культуре клеток куриных эмбрионов;

6. пассажей на куриных эмбрионах (в амниотическую полость);

3 пассажа в культуре клеток куриных эмбрионов;
8 пассажей в культуре клеток куриных эмбрионов (при 36°С);

40. пассажей в культуре клеток куриных эмбрионов (при 32°С).

В результате этих пассажей получен современный аттенуированный вакцинный штамм Moraten. Такой вирус слабо размножался в привитом организме и вызывал слабо выраженные признаки болезни у приматов. Вакцинный штамм имел множественные мутации, часть из которых была связана с изменением прикрепительного белка. Успех вакцинации этим штаммом был обусловлен его слабой репликацией, потомство вирионов часто оставалось на месте репликации, и вакцинация вызывала слабую или инапарантную инфекцию у отдельных пациентов. В дальнейшем аттенуация этого штамма была продолжена разными авторами, в результате чего получены новые вакцины (Загреб, ALK-C, САМ, Ленинград 16, Шанхай-191). Уровень антител у вакцинированных зависел от возраста пациента и наличия материнских антител. Полиморфизм генов, ответственных за иммунный ответ, также оказывал влияние на сероконверсию. Обычно одна доза (3,0—4,0 lg БОЕ) вакцины вызывала сероконверсию у 80-95% привитых [670]. Когда дозу вакцины для детей 4—6 месячного возраста увеличивали в 10—100 раз, сероконверсия усиливалась [736]. Однако применение высокотит- ражной вакцины в странах с высокой детской смертностью сопровождалось увеличением смертности девочек в последующие 2—3 года [791, 899].
Иммунный ответ на живую вакцину подобен иммунному ответу на естественную инфекцию, хотя вакцинальный иммунитет более вариабельный и менее продолжительный. Для предупреждения вспышки кори с учетом ее высокой контагиозности необходимо, чтобы по крайней мере 98% населения было серопозитивными. Роль латентного инфицирования на фоне недостаточного иммунитета в поддержании вируса неизвестна. Корь остается наиболее распространенным заболеванием людей в разных частях света. В центре современной стратегии борьбы с корью остается одновременная массовая вакцинация. Теоретически, корь является идеальным объектом для ликвидации путем иммунизации живой вакциной. Вирус имеет один серотип, большинство случаев болезни легко распознается клинически, не существует животных носителей вируса и существуют эффективные вакцины [736].
Живые вакцины Jery Lynn, Urabe, Am9 и Ленинград-3 против эпидермического паротита получены путем аттенуации вируса серийным пассированием в
куриных эмбрионах (КЭ) и в культуре клеток КЭ. Каждая из этих вакцин представляет собой смесь нескольких аттенуированных штаммов. Например, штамм Jery Lin В аттенуирован пассажами в куриных эмбрионах (17 пассажей) и в культуре клеток куриных эмбрионов. Вакцина из этого штамма представляет собой смесь, по крайней мере, двух аттенуированных штаммов JL5 и JL2 в соотношении 5:1. После однократного парентерального применения живых вакцин ВНА появляются в течение 2 недель у 95% привитых и могут сохраняться более 19 лет [448]. Для профилактики паротита в России применяют живую вакцину Ленинград-3 из аттенуированного штамма (Л-3), размноженного в первичной культуре клеток японских перепелов. Иммунитет развивается примерно у 60% привитых (gt; 10 ООО ТЦД50) и сохраняется не менее 8 лет [115].
Попытки аттенуировать вирус ветряной оспы увенчались успехом. С этой целью его пассировали в культурах клеток эмбриона человека и морской свинки, а затем в диплоидных клетках человека WI-38. Вакцина из аттенуированного штамма «Ока» оказалась слабореактогенным безопасным препаратом, создающим иммунитет более чем у 90% детей сроком на один год [854]. Установлено, что во время пассирования в культуре штамм «Ока» претерпел множество мутаций, о чем свидетельствует потеря, по крайней мере, шести сайтов рестрикции, однако основа его аттенуации не выяснена [1131]. При использовании миллионов доз этой вакцины в США очень редко отмечали незначительные осложнения [448]. Вакцина из штамма «Ока» — первая живая вакцина против вирусов герпеса человека.
Вирус краснухи аттенуировали серийными пассажами в различных культурах клеток, в результате которых получено несколько вакцинных штаммов. Среди них вакцина HPV77/DE5 из вируса размноженного в культуре клеток эмбриона уток, широко используемая в Северной Америке. Вакцину из штамма Cendehill использовали в Европе. Несколько аттенуированных штаммов получены в Японии [921].
Иммунитет у вакцинированных связан с циркулирующими антителами, которые появляются через 2—3 недели после вакцинации и сохраняются 20 лет [115]. Эффективная иммунизация предусматривает двукратную вакцинацию на втором году жизни и после 6 лет при вакцинации 95% детей. В России зарегистрированы живые вакцины против краснухи Рудивакс (Франция), SII (Индия) и вакцина MMR (США) против кори, паротита и краснухи. Вакцину MMR прививают лицам старше 15 лет. После однократного введения сероконверсия к трем вирусам развивается не менее, чем у 95% привитых. Антитела сохраняются более 11 лет [115].
С целью получения живой безопасной иммуногенной вакцины штамм Н2 вируса гепатита А серийно размножали в культуре клеток почки новорожденных обезьян, а затем в культуре фибробластов человека (КМВ17). Этой вакциной в Китае привито более 20 млн человек, и не было отмечено случаев вакцинального гепатита или выделения вакцинного вируса с фекалиями [1004].
Аттенуированный вакцинный штамм ТС-83 вируса венесуэльского энцефаломиелита лошадей получен в результате 45 пассажей вирулентного штамма в куль
туре клеток сердца морской свинки [889]. Аналогичный штамм-15 этого вируса получен серийным пассированием вируса в культуре клеток куриного эмбриона.
Испытания, проведенные на добровольцах, показали, что живая вакцина против цитомегаловирусной инфекции человека из штамма Таун была безопасной и защищала от заболевания, но не от инфицирования полевым штаммом вируса. Вакцинный вирус не выделялся из организма привитых пациентов.
Единичные точечные мутации в геноме многих вирусов сопровождаются аминокислотными заменами в поверхностных белках и аттенуацией. Так было с вирусами лихорадки долина Рифт, Синдбис, клещевого и японского энцефалитов и другими вирусами [169]. У аттенуированного штамма ТС-83 вируса венесуэльского энцефаломиелита лошадей выявлены замены одной аминокислоты в Е-1, пяти аминокислот в Е2 и делеция в З'-концевой некодирующей области генома [889].
Вакцинный штамм 17-D вируса желтой лихорадки содержит мутации в гене, кодирующем протективный гликопротеин VP3. Нуклеотидная дивергенция вакцинного штамма составляла 1% [1081].
Тканевой тропизм и нейровирулентность реовирусов млекопитающих и птиц определяются генными сегментами S-1, кодирующими поверхностный белок Q-1. Вирионный белок Q-1 реовирусов так же, как VP1 пикорнавирусов, ответственен за тропизм к клеткам хозяина и представляет главную мишень для нейтрализующих антител [1702].
Природно аттенуированные мутанты реовируса с измененным тропизмом к клеткам центральной нервной системы могут быть изолированы экспериментально селекцией вируса с изменениями в капсидном протеине Q-1 [1131]. Рео- вирусные мутанты проявляют пониженный тропизм к специфическим участкам мозга, хотя размножаются нормально во внутренних органах экспериментально инфицированных мышей.
Выявлена интересная зависимость между вирулентностью коронавирусов кошек и клеточным тропизмом. Вирулентные штаммы в основном поражают моноциты авирулентные - реплицируются в эпителии кишечника [1457].
В аттенуации вируса простого герпеса важная роль принадлежит гликопротеинам. Мутанты вируса с делециями в генах гликопротеинов G и Е оказались аттенуированными для мышей. Гликопротеины D [1117] и Н [580] также играют существенную роль в тканевом тропизме и инфекционности вируса. Делеция аминокислотных остатков в положении 324—244 гликопротеина D полностью исключает эти функции [1117]. Определенный вклад в инфекционность вируса вносит гликопротеин С. Вирус, лишенный gC, в 10—20 раз имел меньшую инфекционность по сравнению с исходным [770].
С целью выяснения роли отдельных генов в вирулентности вируса болезни Ауески были получены мутанты с делециями 1—3 генов, кодирующих гликопротеины оболочки вириона. Делеционные мутанты по одному гену gl или gill обладали пониженной вирулентностью для свиней и однодневных цыплят, тогда как мутанты, дефектные по двум генам, кодирующим гликопротеины gill и gl
или gill и gp63, оказались полностью авирулентными для указанных животных. Из этого следует, что вирулентность вируса болезни Ауески является синергид- ной функцией отдельных экспрессируемых генов, а репродукция вируса в культуре не коррелирует с вирулентностью [1065]. Полигенный контроль вирулентности обнаружен также у вируса долины Рифт [1363].
Аттенуация для обезьян реассортантов вирусов гриппа птиц и человека детерминирована геном нуклеопротеина [1433].
Вирулентные штаммы вируса гриппа, в отличие от авирулентных, имеют протеолитически расщепленный НА, что зависит, по-видимому, от наличия основных аминокислоту С' конца НА-1, которые распознаются клеточными протеазами. Инфекционная форма вируса гриппа с расщепленным НА при инфекции млекопитающих образуется только в поверхностных клетках дыхательного тракта [1624].
Аттенуация вируса гриппа А птиц также связана с изменением его НА. Репродукция вирулентных штаммов вируса гриппа кур сопрождалась расщеплением НА, тогда как размножение авирулентных штаммов нуждалось в экзогенном трипсине. В отличие от вирулентного штамма, вызывающего у кур системное поражение органов, включая лимфоидные ткани, его аттенуированный вариант не поражал лимфоидные ткани [441]. Мутации в гене, гемагглютинина вируса гриппа А птиц сопровождались аттенуацией вируса, связанной с изменением его клеточного тропизма [1242].
Различия авирулентных штаммов вируса ньюкаслской болезни связаны с изменениями в структуре HN-гена, кодирующего гемагглютинин-нейраминидазу. Большинство аминокислотных замен располагалось в четырех участках N'-koh- ца HN белка [1635]. Имеются данные, свидетельствующие о связи вирулентности вируса ньюкаслской болезни и вируса Сендай с расщеплением гликопротеина слияния (белок Fo) клеточными протеазами [718, 813] или изменением других свойств белков F и HN [1376].
Нуклеотидная дивергенция в гене НА аттенуированного штамма вируса чумы крупного рогатого скота в 3'-концевом некодирующем участке генома была более выраженной, чем внутри кодирующей области [1695]. Вакцинный штамм RA 27/3 вируса краснухи отличался от исходного вирулентного штамма заменой 31 аминокислотного остатка в капсидном белке и в гликопротеине Е-1 — 12 заменами, Е-2 — семью заменами [1147].
Негемагглютинирующий мутант парвовируса собак отличался от исходного «дикого» штамма мутацией генов, кодирующих поверхностные белки VP1 и VP2. Адаптация буньявирусов к клеткам комаров сопровождалась изменением гликопротеинов оболочки вируса и чувствительности к нейтрализующему действию моноклинальных антител [842]. Важная роль в определении спектра биологических переносчиков арбовирусов принадлежит наружным белкам вириона, участвующим в прикреплении вируса к поверхности клеток хозяина [1469].
С помощью нейтрализующих моноклональных антител из популяции вирулентного вируса бешенства удается селекционировать варианты с измененным
поверхностным гликопротеином и признаками аттенуации для центральной нервной системы. Мутант вируса бешенства, характеризовавшийся двумя аминокислотными заменами (лейцин-132 —gt;- фенилаланин; аргинин-333 —> глютамин), утратил нейровирулентность для взрослых мышей [1521].
Вирулентность штаммов ERA и GVS вируса бешенства для мышей зависела от наличия аргинина или лизина в положении 333 вирусного гликопротеина [113]. Замена аргинина в положении 333 на лейцин, изолейцин, метионин, цис- тин или серии полностью лишала эти штаммы вирулентности [1551]. По всей вероятности, такие варианты характеризовались минимальным количеством точечных мутаций и, как следствие, — реверсибельностью.
Так как ts мутанты вирусов гриппа и респираторно-синциальной инфекции оказались генетически не стабильными, аттенуацию многих вирусов стали проводить серийным пассированием в культурах клеток при постепенном снижении температуры выращивания (37—22°С).
Поскольку Са-мутанты обладали большей стабильностью фенотипа при репликации в организме, они получили преимущественное развитие и практическое использование, в том числе при получении реассортантных вакцин.
Первоначально созданные живые вакцины против кори и краснухи были недостаточно аттенуированы. Дальнейшее пассирование вируса в культуре клеток и селекция холодоадаптированных (Са) мутантов позволили получить безвредные вакцинные штаммы [1131].
Вирус парагриппа 3 человека после 45 пассажей при пониженной температуре (22—20°С) приобрел аттенуированный фенотип. Он размножался у человека и обезьян только в верхних дыхательных путях при интраназальном введении и вызывал выраженную сероконверсию и устойчивость к заражению вирулентным штаммом вируса [750]. Такой штамм частично терял ts фенотип размножаясь в организме шимпанзе, хотя оставался достаточно аттенуированным. Каждый из 135 изолятов выделенных от вакцинированных детей сохранял Са и ts фенотип. «Холодный» вариант вируса отличался от полевого исходного вируса 20 мутациями в том числе 10 заменами аминокислот в NP, С, М, F, HN и L белках [472].
Аттенуированный Са мутант вируса инфекционного бронхита кур (тип Арканзас) получен путем серийного пассирования при пониженной температуре (35—28°С). Вирус в основном размножался в верхних дыхательных путях и очень слабо в других органах (40—42°С). Он оказался авирулентным для 3-, 7-дневных цыплят-бройлеров. Доза вакцины, обеспечивающая 100%-ную защиту привитой птицы, соответствовала 103—105 ЭИД50.
Аттенуированный штамм ТД-97 вируса кори получен путем длительного пассирования (более 60 пассажей) в культурах клеток человека, обезьян, морских свинок, куриных эмбрионов при обычной и пониженной температуре (35; 30°С) в сочетании с УФ-облучением с целью мутационного повреждения РНК с селекцией измененных вариантов методом бляшек [169].
Вакцина против инфекционного перитонита кошек разработана на основе температурно-чувствительного мутанта вируса. При интраназальном введении
вирус реплицировался только в верхних дыхательных путях и инактивировался в других органах. При испытаниях на кошках в экспериментальных условиях из 20 вакцинированных животных после контрольного заражения заболело три, а в группе не-вакцинированных — все 12, из них погибли 10. У вакцинированных животных образовались сывороточные и секреторные нейтрализующие антитела, а также развился клеточный иммунный ответ. Полевые испытания подтвердили безопасность и эффективность вакцинации [702].
Первый аттенуированный штамм вирус гепатита А получен путем серийного пассирования в культуре клеток при пониженной температуре. Он прошел 15 пассажей в культуре клеток почек обезьяны при 35°С, пять пассажей при 32°С и четыре пассажа — в диплоидных клетках почки человека. Штамм потерял способность заражать обезьян оральным путем, сохранив иммуногенность. Недостатком вакцины являлась потенциальная опасность реверсии с возможной передачей вакцинного штамма по контакту. Аттенуированный штамм отличался от исходного вирулентного вируса заменой 25 нуклеотидов. В том числе в 5'-концевой некодирующей области генома обнаружено семь замен и пять де- леций. Из 12 замен аминокислотных остатков только одна обнаружена в белке VP1 [513].
Аналогичный штамм получен при пассировании полевого штамма вируса (НМ 175) в культуре клеток AGMK при 35°С 32 раза [1421]. Вакцинный штамм Н2 аттенуирован пассированием в культуре клеток почки новорожденных обезьян, а затем в фибробластах легких человека (КМВ17). Вакциной из этого штамма привито более 20 млн человек в Китае — с хорошей эффективностью. Вирус не выделялся из организма привитых и не обнаружил реверсии.
Вакцинный штамм GPE— вируса классической чумы свиней (КЧС) — получен пассированием штамма ALD в разных клеточных культурах при 30°С. Он прошел 142 пассажа в культуре клеток тестикул свиней и клонирован методом предельных разведений, 36 пассажей в культуре клеток тестикул крупного рогатого скота — и вновь клонирован тем же методом, затем 41 пассаж в культуре клеток почки морской свинки. Вакцинный штамм GPE-, в отличие от исходного вирулентного штамма, хорошо размножался в культуре клеток морской свинки (G-маркер) при 30°С и плохо при 40°С (Т-маркер). Испытание на поросятах подтвердило его безопасность и высокую иммуногенную активность [14071. Геном штамма GPE-отличался от родительского заменой 225 нуклеотидов [1409]. На его основе создали GPE-вакцину, которая успешно применяется в Японии [628].
Штамм Tiverval вируса КЧС получен из вирулентного штамма Альфор после более чем 170 серийных пассажей в культуре клеток при 29—30°С и его можно идентифицировать несколькими маркерами in vitro [269]. По безопасности и им- муногенности он подобен другим вакцинным штаммам вируса КЧС.
В качестве живой вакцины против ящура испытывали «холодный» вариант вируса тип Oj, который прошел 120 пассажей в первичной культуре клеток почки телят при 24°С. При испытании в лабораторных условиях штамм (О, — 24°-120) обнаружил аттенуированный фенотип. Он оказался авирулентным для

КРС, морских свинок и 7-мидневных мышей, не передавался горизонтально и вызывал иммунитет [67]. Сухая вакцина из этого штамма была испытана на серонегативном КРС (более 7 ООО голов) в двух республиках СССР в зоне с умеренным климатом, в летний период (температура воздуха +20 +30°С). Результаты этих испытаний полностью подтвердили результаты лабораторных исследований. Однако прививка этой вакциной КРС в зимний период при содержании практически на открытом воздухе при температуре — 25—30°С вызывала осложнения у 7 из 96 животных, связанные с реверсией вирулентности аттенуированного штамма. Причиной реверси, вероятно, явилось резкое понижение температуры конечностей, особенно в области копыт, где вирус ящура обычно размножается в естественных условиях. Выделенный от вакцинированных животных вирус сохранял некоторые исходные свойства: размножался при 24°С и не вызывал гибели новорожденных мышей. Полученные результаты демонстрируют пример реверсии in vivo, зависящий от температуры.