MED24INfO

Новой потенциально полезной стратегией иммунизации явилось внутримышечное или внутрикожное введение плазмидной ДНК, кодирующей вирусные
протективные антигены. Открытые возможности использования ДНК в качестве вакцины явились наиболее революционным достижением стремительно развивающейся технологии рекомбинантной ДНК. Создание ДНК-вакцин стало возможным благодаря разработке вирусных векторных систем. Повышению эффективности доставки ДНК в клетки и установлению длительной экспрессии чужеродной ДНК в трансфицированных клетках организма.
Новое направление в иммунопрофилактике называют «генетической иммунизацией» или «иммунизацией нуклеиновыми кислотами» [1493, 1677].
Хотя способность ДНК и РНК вызывать синтез соответствующих белков после их проникновения в клетку известна давно, только недавно была осознана возможность данной технологии для создания специфического иммунитета. Новый принцип иммунизации состоит в том, что в организм вводят не вирусный антиген, а ДНК, кодирующую синтез этого антигена (белка). Оказалось, что вирусная ДНК сама по себе может быть использована как вакцина. Детальный анализ развития исследований в этом направлении показал, что такое не является сюрпризом. Было известно, что ДНК и РНК многих вирусов, инфицируя клетки, могут осуществлять полный цикл репликации.
В 1990 г. Вульф и сотр. [1677] обнаружили, что плазмидная конструкция ДНК, включающая ген галактозидазы, введенная в скелетную мышцу мыши, длительно (до 60 дней) экспрессирует фермент. Вскоре после этого было показано, что после ДНК-вакцинации у животных образуются специфические антитела [1493], развивается клеточный иммунитет и защита от вирусной инфекции [1558].
Экспрессия чужеродных генов in vivo может обходиться без сложных систем, используя прямое введение плазмидной ДНК. ДНК-экспрессируюшие векторы для этих целей могут быть реализованы несколькими путями. Простейшим и неожиданно одним из наиболее эффективных методов является введение ДНК в солевом растворе («голая» ДНК).
Введение плазмидной ДНК, содержащей репортерные гены, в солевом растворе вызывает экспрессию белков in vivo [1677].
ДНК-вакцины обычно содержит плазмиду E.coli с сильным промотором и репортерный ген. Плазмида амплифицируется обычно в E.coli, очищается, суспендируется в буферном растворе, а затем просто вводится в организм.
Рекомбинантные плазмиды представляют собой конструкции, содержащие гены, способные экспрессировать нужные вирусные антигены. Клетки организма, по крайней мере вначале, в месте инъекции трансформируются плазмидой, ДНК транспортируется к ядру, где транслируется интересующий (репортерный) белок. Экспрессия репортерных генов обнаружена в мышцах, селезенке, печени, коже, легких и мозге. Однако наиболее выраженная экспрессия обнаружена в мышцах. Ее можно было обнаружить в течение минуты после инъекции. Она максимально проявлялась через 1—2 недели, а затем постепенно снижалась, но могла быть обнаружена, по крайней мере, через 19 месяцев. Механизм интернализации ДНК клетками еще не выяснен и неизвестно, почему мышечные клет
ки являются наиболее эффективной клеточной мишенью трансфекции при прямом введении ДНК. Простое объяснение, состоящее в том, что ДНК просачивается в клетки в результате повреждения при введении, не подтверждено экспериментально. Скорее можно предположить, что в этом могут участвовать физиологические процессы включения ДНК. Так как внутримышечная иммунизация оказалась наиболее эффективной, вначале думали, что трансфицированные ми- оциты ответственны за поддержание продукции антигена и функционируют как антиген-презентирующие клетки. Сейчас считают, что для этого требуются «профессиональные» антиген-презентирующие клетки, происходящие из костного мозга, эти клетки инфильтрируют место присутствия антигена и играют роль местного лимфоузла. Также может иметь место прямая трансфекция анти- ген-презентирующнх клеток, особенно клеток лангерганса при внутрикожном введении [1130].
Иммунизация ДНК имеет некоторые преимущества перед иммунизацией очищенными вирусными антигенами. Наиболее важным преимуществом является то, что вирусные антигены, такие как вирусные гликопротеины, могут экспрессироваться на поверхности трансфецированных клеток и представляться иммунной системе в нативном виде. В процессе очистки вирусных белков, сборки и очистки ВПЧ или химической инактивации вирусов структура эпитопов на протективных белках может быть нарушена и вызовет ослабление иммуногенности. ДНК-иммунизация устраняет эти проблемы и больше напоминает иммунизацию живыми вирусными вакцинами, чем неживыми вирусными антигенами. Вирусные антигены, кодируемые ДНК, эффективно презентируются и вместе с антигенами МНС I вызывают индукцию Тх- и Тц-лимфоцитов. Таким путем они способны вызывать сбалансированный иммунный ответ, более сходный с по- стинфекционным иммунитетом, чем с иммунитетом на преформированные вирусные антигены. Другим преимуществом иммунизации ДНК является способность трансфицировать клетки без интерференции с вирусными антителами. Наконец, чужеродные антигены могут экспрессироваться in vivo в течение нескольких месяцев после ДНК-иммунизации. Однако иммунный ответ при этом может развиваться медленно. Этот метод иммунизации еще не оптимизирован, хотя предложены различные усовершенствования [1493, 1677].
Значительное усиление ответа на вакцинацию достигнуто включением плаз- мидной ДНК в микрочастицы диаметром 1—3 мкм, покрытые золотом и вводимые путем «бомбардировки» с помощью гелевого газового «пистолета» (генный пистолет). Введение таким образом 1 мкг ДНК является достаточным. В опытах с другими рекомбинантными вакцинами включали гены, кодирующие иммуностимулирующие белки, такие как интерлейкин-2, интерлейкин 12 и интерферон гамма [1245].
Преимущества ДНК-вакцин заключаются в чистоте, физико-химической стабильности, относительно низкой стоимости производства, простоте доставки, включении в одну плазмиду генов, кодирующих множество антигенов, и экспрессии антигенов в их нативной форме (что облегчает процессинг и презента
цию иммунной системе). Повторное введение не сопровождается интерференцией, но сопровождается гуморальным и клеточным (Тц и Тх) ответом. Одна из особенностей ДНК-иммунизации состоит в том, что она эффективна в присутствии материнских антител. Главным недостатком ДНК-вакцин является возможная опасность, связанная с введением чужеродной генетически измененной ДНК, интеграпия которой в хромосомную ДНК может привести к связанному с инсерцией мутагенезу или онкогенезу, индукцией аутоиммунного состояния или толератности. Плазмиды используют из-за отсутствия репликации и, более того, отсутствия саморепликации ДНК при использовании ее в качестве вакцины. Плазмиды, содержащие вирусную ДНК, конструируются без последовательностей, которые способны интегрировать ее в хромосомальную ДНК.
В последнее время введением ДНК-вакцин различным видам животных экспрессирован широкий спектр антигенов, в результате чего установлено развитие длительного гуморального и клеточного иммунитета. На различных животных моделях с использованием метода контрольного заражения показано, что ДНК- вакцины, кодирующие вирусные антигены, эффективно защищают от соответствующих инфекций [670].
Таблица 27. Показательные результаты испытания ДНК вакцин [670] (В скобках указан вид животных, на которых использовали вакцины)

Вирус	Белки	Индукция антител	Индукция Тц лимфоцитов	Защита от экспериментального заражения
Вирус Ринотрахеита КРС	gD	+	+	+ (КРС)
Вирус гепатита В	Структурные антигены	+ (обезьяны)	+ (обезьяны)	+ (обезьяны)
Вирус гепатита С	Нуклеокапсид	+	+	+ (мыши)
Вирус простого герпеса тип 1	gD, gB	+	+	+ (мыши)
ВИЧ тип 1	Env, Gag, Rev	+	+	+ (обезьяны)
Вирус гриппа	HA, Ml,Np	+	+	+ (цыплята, мыши)
Вирус лимфоцитарного хориоменингита	NP	+	+	+ (мыши)
Вирус бешенства	NP, гликопротеин	+	+	+ (обезьяны)
Респираторно- сипцитиальный вирус	гликопротеин	+	+	+ (мыши)