Из химических соединений наиболее часто используют два главных типа инактиваторов: ретикулирующие (разрыхляющие) агенты и алкилирующие агенты.
К ретикулирующим агентам относятся альдегиды, в том числе формальдегид, глютаральдегид и глицидальдегид, из которых наиболее часто используют формальдегид [1300]. К алкирующим агентам относятся бетапропиолактон, эти- ленимин и другие азиридины [579].
Механизм действия инактивирующих агентов, вероятно, заключается в следующем: 1) взаимодействуя с нуклеиновыми кислотами, они делают невозможной их репликацию; 2) вызывают ретикуляцию белков.
Механизм действия инактивирующих агентов лучше изучен применительно к белкам, чем к нуклеиновым кислотам, хотя в целом остается не полностью выясненным. Инактивация вирусов, кажется, основывается на двойном действии ретикуляции белков, взаимодействующих с клеточными рецепторами, и блокаде репликации нуклеиновых кислот. Необходимая концентрация инактивирующих агентов зависит, главным образом, от относительной концентрации белков
Основные характеристики инактивирующих агентов.
и нуклеиновых кислот в инактивируемой среде. Температура и гомогенность инактивируемого субстрата также играют ключевую роль в кинетике инактивации вируса. Возможность обратимости изменений реактивных групп (аминогруппа лизина, фенольные ядра тирозина) необходимо учитывать, особенно в случае использования формальдегида.
Полнота инактивации вируса должна определяться сразу после изготовления вакцины.
Наиболее общепринятыми инактивирующими агентами являются формальдегид, бета-пропиолактон и этиленимин. Одним из преимуществ бета-пропио- лактона, используемого для изготовления вакцины против бешенства, и этиле- нимина, применяемого в изготовлении вакцины против ящура, является то, что они полностью гидролизуются в течение нескольких часов с образованием нетоксичных продуктов.
Формальдегид инактивирует вирусы благодаря высокой реакционной способности в отношении белков и нуклеиновых кислот. Он вступает в соединение не только с вирусными частицами, но и с многочисленными компонентами среды, в которую его добавляют.
Механизм инактивации вирусов формальдегидом сложен и характеризуется двумя типами реакций. Взаимодействие формальдегида с нуклеиновой кислотой и белками вируса протекает, соответственно, по типу реакции первого и второго порядка. Наиболее существенна для инактивации первая, которая, однако, в значительной мере зависит от второй.
Взаимодействуя с нуклеиновыми кислотами и белками, формальдегид реагирует в основном с аминогруппами. Присоединение формальдегида к аминогруппам пуринов и пиримидинов уничтожает матричную и информационную активность нуклеиновых кислот.
Формальдегид с большей скоростью взаимодействует с аминогруппами аминокислот и белков с образованием метилольных производных, чем с азотистыми основаниями нуклеиновых кислот. Сложилось представление, что с белками и нуклеиновыми кислотами вирусов формальдегид реагирует в две стадии. Вначале, в результате взаимодействия формальдегида с амино- или иминогруппами, быстро образуются весьма нестабильные метилольные производные, а затем, в результате вторичных реакций — бисметиленовые производные [88, 197].
Продукты взаимодействия формальдегида с аминокислотами способны вступать в реакцию с нуклеиновыми кислотами значительно быстрее, чем сам формальдегид [88].
Во второй стадии происходит медленное взаимодействие первичных продуктов реакции с другими группами белков, в результате чего образуются ковалентно связанные димеры полипептидов. При этом уплотняется белковая оболочка и уменьшается ее проницаемость. Вследствие этого снижается скорость инактивации вируса [197]. Под влиянием формальдегида в вирионах клещевого энцефалита образовывались гликопротеиновые димеры и комплекс РНК с белками нуклеокапсида. Последний отличался высокой стабильностью и разрушался
только РНКазой. Предполагается, что образование этого комплекса — основной механизм инактивации вируса. Гликопротеин, экстрагированный из инактивированного вируса, обладал нормальной антигенной и иммуногенной активностью [908]. Следует отметить, что реакция формальдегида с аминогруппами обратима, то есть при удалении избытка реагента или разбавлении раствора активность нуклеиновой кислоты может быть восстановлена. Процесс взаимодействия вируса с формальдегидом зависит от таких факторов, как концентрация реагента, температура, pH среды. При оптимальных условиях инактивации взаимодействие формальдегида с белками многих вирусов не оказывает значительного влияния на их антигенные свойства. Однако ряд вирусов теряет значительную часть антигенной активности при инактивации формалином. Это особенно касается оболочечных вирусов и, прежде всего, вирусов кори [351] и респираторно-синцитиального (PC) вируса [1274]. Например, инактивированная формалином вакцина против PC-вируса вызывала образование антител к белку F, которые не подавляли его инфекционную и сим пластообразующую активность [1133]. Более того, вакцинация приводила к осложнению течения болезни при последующем ее возникновении. Вероятно, под действием формалина изменяются эпитопы гликопротеина, ответственные за индукцию вирусней- трализующих антител. Это касается, прежде всего, поверхностного F белка, ответственного за протективный иммунитет [1274]. Однако многие из вирусов, которые относительно хорошо переносят инактивацию формалином, оказываются весьма чувствительными к изменениям ее условий. Повышение концентрации формальдегида в десять и более раз по сравнению с оптимальной (0,1%-ной) приводило к морфологическим изменениям поверхностного антигена вируса гепатита В и снижению его активности [1643], а увеличение продолжительности обработки очищенного полиовируса сопровождалось значительным повреждением капсида некоторых вирионов. С целью смягчения повреждающего действия формальдегида на антигенность и иммуногенность вирусов стали применять стабилизирующие вещества. Установлено, например, что добавление арилдона (5,4 М) не влияет на инактивацию аттенуированных и вирулентных штаммов полиовируса формалином (1:4000, 37°С) и, в то же время, способствует сохранению иммуногенности за счет стабилизации D-антигена [210].
В опытах с герпесвирусом типа I крупного рогатого скота установлено, что в процессе инактивации формальдегидом эпитопы гликопротеинов g I, g II и g IV на 80% теряют способность связывать соответствующие моноклональные антитела. Однако это не коррелировало с их способностью вызывать антительный ответ [609]. Инактивация формальдегидом энтеровирусов не влияла на распознавание группоспецифического антигена Т клетками. В изготовлении инактивированных вакцин, кроме формальдегида, нашел применение глютаровый альдегид. Он вызывает агрегацию вирионов благодаря образованию межмолеку- лярных связей в результате взаимодействия формальдегида с аминогруппами поверхностных белков вирионов. При сшивке белковых молекул альдегидом блокируется до 2/3 остатков лизина. Инактивация глютаральдегидом не сопровож
дается заметным снижением антигенных свойств вирусов, вероятно, благодаря полимеризации белковых молекул.
Бета-пропиолактон представляет собой высокоактивный алкилирующий агент, нестойкий в водных растворах и легко гидролизуемый с образованием безвредных веществ: гидроакриловой и бета-оксипропионовой кислот. В связи с этим отпадает необходимость в нейтрализации избытка бета-пропиолактона и продуктов его распада.
Бета-пропиолактон оказывает инактивирующее действие на многие вирусы. При оптимальной концентрации бета-пропиолактона снижается инфекцион- ность вируса ньюкаслской болезни без существенного изменения гемагглюти- нирующей, нейраминидазной и гемолизирующей активности [169]. Бета-пропиолактон разрушает инфекционность вируса Сендай, не влияя на его антигенные свойства. Высказано предположение, что потеря инфекционности вирусами Сендай и ньюкаслской болезни обусловлена взаимодействием бета-пропиолактона с вирусным геномом. С помощью бета-пропиолактона удалось получить высокоактивные вакцины против бешенства [1304] и неинфекционные антигенноактивные препараты вируса катаральной лихорадки овец [1206], а также инфекционного бронхита птиц [2591.
Инактивация вирусов бета-пропиолактоном зависит от концентрации инактиватора, температуры взаимодействия и содержания белка в вирусной суспензии. Повышение концентрации бета-пропиолактона может привести к нежелательной реакции с вирусными белками и, вследствие этого, к снижению антигенной активности [ 1205].
Из других химических веществ для инактивации вирусов представляет интерес гидроксиламин, который, как и бета-пропиолактон, полностью разлагается в течение короткого периода. Инактивирующее действие гидроксиламина определяется его взаимодействием с пиримидиновыми основаниями нуклеиновой кислоты, зависящим от величины pH. В слабокислой среде происходит, главным образом, изменение цитозина, а в щелочной — урацила [373]. Обработка некоторых вирусов (полиомиелита, бешенства, западного и восточного энцефаломиелита лошадей, гриппа, ньюкаслской болезни, осповакцины и др.) гид- роксиламином при оптимальном режиме инактивации не приводила к существенным изменениям их антигенной активности, что позволило использовать это вещество для изготовления диагностических антигенов и инактивированных вакцин.
В последние годы внимание исследователей привлекли азиридины, и особенно этиленимин и его производные. Этиленимин — насыщенное, гетероциклическое соединение, впервые было синтезировано из бромэтиламина в 1988 г. [12]. Этиленимин, как и другие азиридины, относится к группе высокореакционных алкилирующих соединений, обладающих токсичностью.
Этиленимин и его производные оказывают сильное инактивирующее действие на вирусы, сохраняя их антигенные свойства. Инактивирующий эффект этиленимина на вирусы, по-видимому, объясняется депуринизацией и последу
ющей деполимеризацией нуклеиновых кислот [12]. Замена формальдегида этиленимином основывалась на следующих преимуществах. В отличие от формальдегида, вызывающего образование поперечных связей в вирусных белках, этиленимин оказывал влияние только на нуклеиновую кислоту. При 25°С инактивация вируса представляла собой быстрый, легко контролируемый линейный процесс, а полученные при этом полностью неинфекционные антигены оказались удобными в дальнейшей переработке — концентрировании и очистке [299].
Изучение кинетики инактивации вируса леса Семлики ацетилэтиленими- ном показало возрастание скорости инактивации с увеличением температуры (до 40°С) и концентрации инактиватора (до 0,1%). Оптимальной оказалась температура 37°С, так как при ее снижении ниже 23°С вирус полностью не инактивировался, а при повышении — происходила термоинактивация вируса и потеря протективных свойств. Отмечена перспективность применения аце- тилэтиленимина для приготовления инактивированных вакцин против тогавирусов [240].
Для инактивации вирусов чаще применяют ацетилэтиленимин (АЭИ) и особенно димер этиленимина (ДЭИ), который значительно менее токсичен по сравнению с этиленимином. Использование азиридинов для приготовления инактивированных противовирусных вакцин во многом обязано исследованиям с вирусом ящура.
Одним из стимулов к проведению этой работы были часто наблюдаемые «хвосты» инфекционного вируса в противоящурных вакцинах, инактивированных формалином. Так, в результате обработки 0,05%-ным формальдегидом в течение 144 ч при температуре 26°С и pH 8,9 не получали полной инактивации, тогда как 0,05%-ный ацетилэтиленимин оказался высокоэффективным при воздействии в течение всего 12 ч при 37°С [60].
Азиридины применяли и для инактивации других вирусов, в частности, бешенства (0,05% АЭИ, 65 ч, 37°С), псевдобешенства (0,05% АЭИ, 4% 37°С), пар- вовируса свиней (ЭИ-5 ММ, 48-72 ч, 26°С), везикулярной болезни свиней, классической чумы свиней и гриппа А [60].
Имеются сообщения о большой эффективности производных этиленимина по сравнению с другими инактивирующими агентами. Преимущество заключалось в получении безопасных препаратов с выраженными антигенными свойствами. Преимущества АЭИ по сравнению с бета-пропиолактоном доказаны на примере вирусов ящура, везикулярной болезни свиней и других вирусов. При инактивации вируса лейкоза крупного рогатого скота оптимальные результаты получены с АЭИ и ДЭИ. Оба агента вызывали инактивацию инфекционности вируса, не изменяя активности вирусного гликопротеина, тогда как при инактивации формалином наблюдалось существенное снижение антигенной активности. При инактивации вирусов с дцРНК этиленимин и его производные действовали менее эффективно [60]. Инактивация некоторых вирусов в присутствии CuS04 происходила без потери иммуногенности [171, 204, 205].
Химическая инактивация вирионов технически проста. Однако надежное подавление инфекционности нередко сопровождается существенным снижением других видов биологической активности, в том числе иммуногенности. К тому же, в ряде случаев требуется нейтрализация инактивирующих агентов.
Можно сказать, что все инактивирующие агенты в той или иной степени вызывают изменения как в нуклеиновой кислоте, так и в белковой оболочке. При этом характер изменений вирусных частиц во многом определяется природой инактивирующего агента и возбудителя.
Приготовление эффективных инактивированных вакцин из некоторых оболочечных вирусов (вирус кори, респираторно-синцитиальный и др.) оказалось трудной задачей, поскольку все оболочечные вирусы имеют сложную липопротеиновую оболочку (липидный бислой с встроенными белками), наружные белки которой играют основную роль в индукции протективного иммунитета и часто денатурируются в процессе инактивации и последующего хранения.
Изучение воздействия химических инактиваторов на эпитопы гликопротеинов вируса лихорадки долины Рифт показало, что вскоре после начального периода инактивации этиленимин мало действует на эпитопы. Бета-пропиолактон в значительной мере изменяет структуру семи эпитопов, а формальдегид частично воздействует на конфирмационную структуру большинства из них. Эпитопы всех инактивированных антигенов отличаются сниженной способностью реагировать со специфическими моноклональными антителами в случае хранения их более 6 мес [351].
Опытным путем на различных вирусах установлено, что при щадящих условиях инактивации, как правило, вначале теряется инфекционность, а затем ан- тигенность. Считается, что чем больше разница во времени между утратой этих свойств, тем перспективнее режим инактивации данного вируса.
Изучение механизма взаимодействия инактивирующих факторов с нуклеиновыми кислотами и белками вирусов, а также выяснение структурных и функциональных модификаций этих макромолекул поможет сделать выбор оптимальных условий инактивации вирусов с учетом их групповых и индивидуальных особенностей.
Первым реагентом для изготовления многих вирусных инактивированных вакцин был формальдегид. Около 50 лет назад была предложена инактивированная формалином сорбированная вакцина против ящура [ 1607], технологию изготовления которой совершенствовали в течение многих лет. На ранних этапах широкого применения такой вакцины имели место случаи неполного обезвреживания вируса ящура, что нередко приводило к вспышкам заболевания в европейских странах [60, 398]. Все это создало необходимость изыскать новые методы инактивации, обеспечивающие полную потерю инфекционных свойств вируса без снижения его антигенности, в результате чего предпочтение было отдано ацетилэтиленимину [398]. Однако в последнее время представлены новые доказательства в пользу пригодности формальдегида для приготовления безопасной противоящурной вакцины. Этому способствовало использование
фильтрованной вирусной суспензии, инактивация вируса перед добавлением ГОА и соблюдение общепринятого режима инактивации (0,04% формалина; pH 8,5; 25°С). Исключение адсорбации вируса перед добавлением формалина значительно облегчает контроль кинетики инактивации вируса, а также позволяет проводить очистку и концентрирование инактивированного вирусного антигена. При длительном хранении иммуногенность формолвакцины была выше, чем вакцины, инактивированной АЭИ [298]. Сохранность полных вирионов (1468- частиц) через 1 год (4°С) после инактивации формальдегидом глицилальдегидом и бета-пропионлоктоном соответственно составляла 30—50%, 80—90% и 10—20% [674]. Д. Солк и сотрудники, используя культуральный вирус и формалин, впервые в истории профилактики полиомиелита получили безопасную инактивированную вакцину. Фильтрованный вирус инактивировали формалином (1:4000; 37°С; pH 7,0; 12 суток). В дальнейшем, инактивированная формалином трехвалентная вакцина против полиомиелита повышенной активности была приготовлена в институте Мерье (Франция) из вируса, выращенного в культуре клеток Vero на микроносителе.
Вакцина против болезни Тешена, инактивированная бета-пропиолактоном, оказалась более иммуногенной, чем формолвакцина, полученная аналогичным образом, тогда как другие исследователи при создании инактивированных вакцин против африканской чумы лошадей и болезни Тешена отдавали предпочтение формалину [ 169].
Вирус африканской чумы лошадей инактивировали бета-пропиолактоном (30 мин, 25°С) или формалином (48 ч, 25°С). Иммуногенная активность обоих антигенов, сорбированных на гидрате окиси алюминия, была одинаковой [1077, 1205]. Бета-пропиолактон оказался эффективным средством при изготовлении инактивированных вакцин против ньюкаслской болезни и везикулярной болезни свиней [559].
Вирус гепатита А, адаптированный к культуре клеток человека, концентрировали преципитацией сульфатом аммония и инактивировали бета-пропиолактоном. Вакцина обладала выраженной антигенностью, вызывая длительную персистенцию антител у вакцинированных животных. Другие авторы при изготовлении вакцины против гепатита А вирус выращивали в культуре диплоидных клеток человека MRC-5. Очищенный и концентрированный вирус инактивировали формальдегидом, консервировали 2-феноксиэтанолом, а в качестве адъюванта добавляли ГОА. Одна доза (1 мл) вакцины, содержащая 720 ед. (ИФА) вирусного антигена, вызывала практически 100%-ную сероконверсию у взрослых, а после бустеризации обеспечивала защиту сроком не менее 10 лет [245, 1237]. Аналогичная вакцина при испытании на обезьянах и морских свинках обладала выраженной антигенностью и иммуногенностью [97]. Инактивированная вакцина против гепатита А была лицензирована в ряде европейских стран. Лицензированная вакцина 5 КВ для взрослых содержала 1,440 единиц/мл вирусного антигена (определение в стандартном ИФА), 0,5 мг. А1(ОН)3 в качесте адъюванта и 2-феноксиэтанол в качестве консерванта. Первичную иммунизацию прово
дили внутримышечно одной дозой вакцины, бустеризация — через 6—12 месяцев усиливала иммунитет. Для иммунизации детей использовали уменьшенную дозу вакцины. При ускоренном методе старения при 37°С вакцина сохраняла активность 3 недели, а при 2-8°С - 15 месяцев [1237].
Другой аналогичной лицензированной вакциной является вакцина VAQTA. Очищенный концентрированный частично аттенуированный вирус инактивировали формальдегидом и сорбировали на гидрате окиси алюминия. У вакцинированных шимпанзе в течение 2 недель развивались ВНА и они были защищены от внутривенного заражения вирулентным вирусом гепатита А. Обе инактивированные вакцины были безопасны и иммуногены для людей [245].
Инактивированную сорбированную вакцину против кори применяли трехкратно. Иммунизация сопровождалась образованием различного уровня нейтрализующих антител и антител, подавляющих ГА. Вакцинированные пациенты были защищены от заболевания в течение нескольких месяцев после иммунизации. Титр антител быстро снижался и они вновь становились чувствительными к естественному заражению [736, 1561].
Вакцину против клещевого энцефалита готовили из культурального вируса, инактивированного формалином после фильтрации, затем его очищали, концентрировали градиентным центрофугированием. Полученный препарат не обладал реактогенностью и обнаружил выраженную антигенность на добровольцах [359] и иммуногенность на мышах [631].
В производстве инактивированных антирабических вакцин наиболее часто применяют бета-пропиолактон. Высокоиммуногенным безопасным препаратом является вакцина из концентрированного и очищенного культурального вируса бешенства, инактивированного бета-пропиолактоном (в течение 18 ч при температуре 4°С, а затем 2 ч при 37°С). Такую вакцину производили в США, Франции, Германии [117]. Аналогичная инактивированная вакцина получена из очищенного вируса, выращенного в культуре клеток Vero [895]. Сорбированную вакцину против бешенства для ветеринарной практики готовили из ткани мозга инфицированных мышей, крыс или из культурального вируса. Вирус инактивировали бета-пропиолактоном.
Инактивированные вакцины против эпидемического паротита менее эффективны, чем живые. Формолвакцина вызывала образование антител к HN гликопротеину и к денатурированному F-белку и по-видимому ограничивалась индукцией IgG и слабым клеточным иммунным ответом [448].
Вирус восточного энцефаломиелита лошадей, выращенный в суспензии све- жеизолированных клеток куринного эмбриона, инактивировали формалином или бета-пропиолактоном. Наибольшим защитным эффектом для морских свинок обладала бета-пропиолактоновая вакцина [169].
Вирус геморрагической болезни кроликов, инактивированный формальдегидом, вызывал у привитых животных выраженный протективный эффект. Инактивация вируса бета-пропиолактоном сопровождалась менее выраженным снижением гемагглютинирующей активности и отчетливой иммуногенностью.
Вирус чумы крупного рогатого скота, инактивированный формальдегидом в сочетании с неполным адъювантом Фрейнда, индуцировал у крупного рогатого скота иммунитет продолжительностью один год.
Высокоиммуногенная эмульгированная вакцина получена из вируса болезни Ауески, инактивированного формальдегидом или глутаральдегидом [1530]. Не менее эффективные культуральные вакцины получены с использованием для инактивации вируса этиленимина или этилэтиленимина. По иммуногенной активности они не уступали живой вакцине против болезни Ауески [226].
Инактивированную вакцину против PC-инфекции крупного рогатого скота удалось приготовить из инфицированных вирусом клеток, обработанных глю- таральдегидом. При испытании на телятах эта вакцина оказалась более иммуногенной, чем живая вакцина из аттенуированного штамма PC-вируса крупного рогатого скота и ts-мутанта PC-вируса человека. Для изготовления вакцины против лейкоза крупного рогатого скота использовали постоянную линию клеток FLK, персистентно инфицированную этим вирусом. Клетки инактивировали формальдегидом или глютаральдегидом и добавляли адъювант. Только препарат, инактивированный формальдегидом, обладал протективным действием [744].
Инактивация вируса катаральной лихорадки овец КЛО димером этиленимина (0,04—0,06 %; 37°С; в течение 3—5 дней) позволила получить безопасный вы- сокоиммуногенный препарат. Повышение концентрации ДЭИ и продолжительности обработки вируса в 2—3 раза не снижало заметно его иммуногенности и гарантировало получение безопасного препарата, что свидетельствует о мягком инактивирующем действии ДЭИ на вирус КЛО.
Формолвакцина против артеривирусной инфекции лошадей оказалась достаточно эффективным препаратом. Выраженный иммунный статус поддерживался ревакцинацией через каждые 6 мес. [687].
Вирусы, инактивированные сернокислой медью, сохраняли антигенные и иммунногенньге свойства, а также целостность вирионной ДНК [205].
При инактивации парвовируса свиней формальдегидом гемагглютинирую- щая активность практически исчезла, тогда как при инактивации ДЭИ снижалась незначительно. Однако по антигенности препараты в обоих случаях практически не различались между собой.
Один из способов повышения безопасности инактивированных вакцин на случай неполной инактивации вируса — использование аттенуированных штаммов. Классический пример этого — изготовление инактивированных вакцин из аттенуированных штаммов вируса бешенства. Иммуногенные инактивированные вакцины были получены также из аттенуированных штаммов вируса ньюкаслской болезни, парвовирусов энтерита кошек и собак 1492], вируса болезни Ауески. Изготовление инактивированных вакцин из аттенуированных или частично аттенуированных штаммов вируса усиливает безопасность производства вакцин, что представляет большой интерес при работе с возбудителями опасных болезней.
При изготовлении инактивированных вакцин с учетом непредвиденного распространения болезней и резкого возрастания потребности в средствах специфической профилактики целесообразна разработка методов длительного хранения концентрированных вирусных антигенов при низких температурах. Создание резерва такого вирусного сырья кажется более перспективным, чем создание резерва готового продукта. Аналогичные соображения высказывались в связи с рассмотрением перспективных направлений в специфической профилактике ящура. Установлено, что инактивированная вакцина против ящура, приготовленная из вирусных концентратов, хранившихся в жидком азоте на протяжении года, обладала высокой протективной активностью [595].
К ретикулирующим агентам относятся альдегиды, в том числе формальдегид, глютаральдегид и глицидальдегид, из которых наиболее часто используют формальдегид [1300]. К алкирующим агентам относятся бетапропиолактон, эти- ленимин и другие азиридины [579].
Механизм действия инактивирующих агентов, вероятно, заключается в следующем: 1) взаимодействуя с нуклеиновыми кислотами, они делают невозможной их репликацию; 2) вызывают ретикуляцию белков.
Механизм действия инактивирующих агентов лучше изучен применительно к белкам, чем к нуклеиновым кислотам, хотя в целом остается не полностью выясненным. Инактивация вирусов, кажется, основывается на двойном действии ретикуляции белков, взаимодействующих с клеточными рецепторами, и блокаде репликации нуклеиновых кислот. Необходимая концентрация инактивирующих агентов зависит, главным образом, от относительной концентрации белков
Основные характеристики инактивирующих агентов.
|
|
формальдегид |
бетапропиолактон |
этиленимин |
|
химическая структура реактивных групп |
н - СО 1 н |
СН9-СН9 I I О — со |
сн7-сн9 \ / NH |
|
физические свойства |
35-40% водный раствор |
вязкая жидкость |
вязкая жидкость или водный раствор |
|
способ действия |
ретикулирующий агент |
алкилирующий агент |
алкилирующий агент |
|
кинетика инактивации |
комплексная |
первого порядка |
первого порядка |
|
изменение инактивирующего агента в инактивированном продукте |
устойчив |
быстро гидролизуется |
полимеризуется в полиэтиленимин или медленно гидролизуется |
и нуклеиновых кислот в инактивируемой среде. Температура и гомогенность инактивируемого субстрата также играют ключевую роль в кинетике инактивации вируса. Возможность обратимости изменений реактивных групп (аминогруппа лизина, фенольные ядра тирозина) необходимо учитывать, особенно в случае использования формальдегида.
Полнота инактивации вируса должна определяться сразу после изготовления вакцины.
Наиболее общепринятыми инактивирующими агентами являются формальдегид, бета-пропиолактон и этиленимин. Одним из преимуществ бета-пропио- лактона, используемого для изготовления вакцины против бешенства, и этиле- нимина, применяемого в изготовлении вакцины против ящура, является то, что они полностью гидролизуются в течение нескольких часов с образованием нетоксичных продуктов.
Формальдегид инактивирует вирусы благодаря высокой реакционной способности в отношении белков и нуклеиновых кислот. Он вступает в соединение не только с вирусными частицами, но и с многочисленными компонентами среды, в которую его добавляют.
Механизм инактивации вирусов формальдегидом сложен и характеризуется двумя типами реакций. Взаимодействие формальдегида с нуклеиновой кислотой и белками вируса протекает, соответственно, по типу реакции первого и второго порядка. Наиболее существенна для инактивации первая, которая, однако, в значительной мере зависит от второй.
Взаимодействуя с нуклеиновыми кислотами и белками, формальдегид реагирует в основном с аминогруппами. Присоединение формальдегида к аминогруппам пуринов и пиримидинов уничтожает матричную и информационную активность нуклеиновых кислот.
Формальдегид с большей скоростью взаимодействует с аминогруппами аминокислот и белков с образованием метилольных производных, чем с азотистыми основаниями нуклеиновых кислот. Сложилось представление, что с белками и нуклеиновыми кислотами вирусов формальдегид реагирует в две стадии. Вначале, в результате взаимодействия формальдегида с амино- или иминогруппами, быстро образуются весьма нестабильные метилольные производные, а затем, в результате вторичных реакций — бисметиленовые производные [88, 197].
Продукты взаимодействия формальдегида с аминокислотами способны вступать в реакцию с нуклеиновыми кислотами значительно быстрее, чем сам формальдегид [88].
Во второй стадии происходит медленное взаимодействие первичных продуктов реакции с другими группами белков, в результате чего образуются ковалентно связанные димеры полипептидов. При этом уплотняется белковая оболочка и уменьшается ее проницаемость. Вследствие этого снижается скорость инактивации вируса [197]. Под влиянием формальдегида в вирионах клещевого энцефалита образовывались гликопротеиновые димеры и комплекс РНК с белками нуклеокапсида. Последний отличался высокой стабильностью и разрушался
только РНКазой. Предполагается, что образование этого комплекса — основной механизм инактивации вируса. Гликопротеин, экстрагированный из инактивированного вируса, обладал нормальной антигенной и иммуногенной активностью [908]. Следует отметить, что реакция формальдегида с аминогруппами обратима, то есть при удалении избытка реагента или разбавлении раствора активность нуклеиновой кислоты может быть восстановлена. Процесс взаимодействия вируса с формальдегидом зависит от таких факторов, как концентрация реагента, температура, pH среды. При оптимальных условиях инактивации взаимодействие формальдегида с белками многих вирусов не оказывает значительного влияния на их антигенные свойства. Однако ряд вирусов теряет значительную часть антигенной активности при инактивации формалином. Это особенно касается оболочечных вирусов и, прежде всего, вирусов кори [351] и респираторно-синцитиального (PC) вируса [1274]. Например, инактивированная формалином вакцина против PC-вируса вызывала образование антител к белку F, которые не подавляли его инфекционную и сим пластообразующую активность [1133]. Более того, вакцинация приводила к осложнению течения болезни при последующем ее возникновении. Вероятно, под действием формалина изменяются эпитопы гликопротеина, ответственные за индукцию вирусней- трализующих антител. Это касается, прежде всего, поверхностного F белка, ответственного за протективный иммунитет [1274]. Однако многие из вирусов, которые относительно хорошо переносят инактивацию формалином, оказываются весьма чувствительными к изменениям ее условий. Повышение концентрации формальдегида в десять и более раз по сравнению с оптимальной (0,1%-ной) приводило к морфологическим изменениям поверхностного антигена вируса гепатита В и снижению его активности [1643], а увеличение продолжительности обработки очищенного полиовируса сопровождалось значительным повреждением капсида некоторых вирионов. С целью смягчения повреждающего действия формальдегида на антигенность и иммуногенность вирусов стали применять стабилизирующие вещества. Установлено, например, что добавление арилдона (5,4 М) не влияет на инактивацию аттенуированных и вирулентных штаммов полиовируса формалином (1:4000, 37°С) и, в то же время, способствует сохранению иммуногенности за счет стабилизации D-антигена [210].
В опытах с герпесвирусом типа I крупного рогатого скота установлено, что в процессе инактивации формальдегидом эпитопы гликопротеинов g I, g II и g IV на 80% теряют способность связывать соответствующие моноклональные антитела. Однако это не коррелировало с их способностью вызывать антительный ответ [609]. Инактивация формальдегидом энтеровирусов не влияла на распознавание группоспецифического антигена Т клетками. В изготовлении инактивированных вакцин, кроме формальдегида, нашел применение глютаровый альдегид. Он вызывает агрегацию вирионов благодаря образованию межмолеку- лярных связей в результате взаимодействия формальдегида с аминогруппами поверхностных белков вирионов. При сшивке белковых молекул альдегидом блокируется до 2/3 остатков лизина. Инактивация глютаральдегидом не сопровож
дается заметным снижением антигенных свойств вирусов, вероятно, благодаря полимеризации белковых молекул.
Бета-пропиолактон представляет собой высокоактивный алкилирующий агент, нестойкий в водных растворах и легко гидролизуемый с образованием безвредных веществ: гидроакриловой и бета-оксипропионовой кислот. В связи с этим отпадает необходимость в нейтрализации избытка бета-пропиолактона и продуктов его распада.
Бета-пропиолактон оказывает инактивирующее действие на многие вирусы. При оптимальной концентрации бета-пропиолактона снижается инфекцион- ность вируса ньюкаслской болезни без существенного изменения гемагглюти- нирующей, нейраминидазной и гемолизирующей активности [169]. Бета-пропиолактон разрушает инфекционность вируса Сендай, не влияя на его антигенные свойства. Высказано предположение, что потеря инфекционности вирусами Сендай и ньюкаслской болезни обусловлена взаимодействием бета-пропиолактона с вирусным геномом. С помощью бета-пропиолактона удалось получить высокоактивные вакцины против бешенства [1304] и неинфекционные антигенноактивные препараты вируса катаральной лихорадки овец [1206], а также инфекционного бронхита птиц [2591.
Инактивация вирусов бета-пропиолактоном зависит от концентрации инактиватора, температуры взаимодействия и содержания белка в вирусной суспензии. Повышение концентрации бета-пропиолактона может привести к нежелательной реакции с вирусными белками и, вследствие этого, к снижению антигенной активности [ 1205].
Из других химических веществ для инактивации вирусов представляет интерес гидроксиламин, который, как и бета-пропиолактон, полностью разлагается в течение короткого периода. Инактивирующее действие гидроксиламина определяется его взаимодействием с пиримидиновыми основаниями нуклеиновой кислоты, зависящим от величины pH. В слабокислой среде происходит, главным образом, изменение цитозина, а в щелочной — урацила [373]. Обработка некоторых вирусов (полиомиелита, бешенства, западного и восточного энцефаломиелита лошадей, гриппа, ньюкаслской болезни, осповакцины и др.) гид- роксиламином при оптимальном режиме инактивации не приводила к существенным изменениям их антигенной активности, что позволило использовать это вещество для изготовления диагностических антигенов и инактивированных вакцин.
В последние годы внимание исследователей привлекли азиридины, и особенно этиленимин и его производные. Этиленимин — насыщенное, гетероциклическое соединение, впервые было синтезировано из бромэтиламина в 1988 г. [12]. Этиленимин, как и другие азиридины, относится к группе высокореакционных алкилирующих соединений, обладающих токсичностью.
Этиленимин и его производные оказывают сильное инактивирующее действие на вирусы, сохраняя их антигенные свойства. Инактивирующий эффект этиленимина на вирусы, по-видимому, объясняется депуринизацией и последу
ющей деполимеризацией нуклеиновых кислот [12]. Замена формальдегида этиленимином основывалась на следующих преимуществах. В отличие от формальдегида, вызывающего образование поперечных связей в вирусных белках, этиленимин оказывал влияние только на нуклеиновую кислоту. При 25°С инактивация вируса представляла собой быстрый, легко контролируемый линейный процесс, а полученные при этом полностью неинфекционные антигены оказались удобными в дальнейшей переработке — концентрировании и очистке [299].
Изучение кинетики инактивации вируса леса Семлики ацетилэтиленими- ном показало возрастание скорости инактивации с увеличением температуры (до 40°С) и концентрации инактиватора (до 0,1%). Оптимальной оказалась температура 37°С, так как при ее снижении ниже 23°С вирус полностью не инактивировался, а при повышении — происходила термоинактивация вируса и потеря протективных свойств. Отмечена перспективность применения аце- тилэтиленимина для приготовления инактивированных вакцин против тогавирусов [240].
Для инактивации вирусов чаще применяют ацетилэтиленимин (АЭИ) и особенно димер этиленимина (ДЭИ), который значительно менее токсичен по сравнению с этиленимином. Использование азиридинов для приготовления инактивированных противовирусных вакцин во многом обязано исследованиям с вирусом ящура.
Одним из стимулов к проведению этой работы были часто наблюдаемые «хвосты» инфекционного вируса в противоящурных вакцинах, инактивированных формалином. Так, в результате обработки 0,05%-ным формальдегидом в течение 144 ч при температуре 26°С и pH 8,9 не получали полной инактивации, тогда как 0,05%-ный ацетилэтиленимин оказался высокоэффективным при воздействии в течение всего 12 ч при 37°С [60].
Азиридины применяли и для инактивации других вирусов, в частности, бешенства (0,05% АЭИ, 65 ч, 37°С), псевдобешенства (0,05% АЭИ, 4% 37°С), пар- вовируса свиней (ЭИ-5 ММ, 48-72 ч, 26°С), везикулярной болезни свиней, классической чумы свиней и гриппа А [60].
Имеются сообщения о большой эффективности производных этиленимина по сравнению с другими инактивирующими агентами. Преимущество заключалось в получении безопасных препаратов с выраженными антигенными свойствами. Преимущества АЭИ по сравнению с бета-пропиолактоном доказаны на примере вирусов ящура, везикулярной болезни свиней и других вирусов. При инактивации вируса лейкоза крупного рогатого скота оптимальные результаты получены с АЭИ и ДЭИ. Оба агента вызывали инактивацию инфекционности вируса, не изменяя активности вирусного гликопротеина, тогда как при инактивации формалином наблюдалось существенное снижение антигенной активности. При инактивации вирусов с дцРНК этиленимин и его производные действовали менее эффективно [60]. Инактивация некоторых вирусов в присутствии CuS04 происходила без потери иммуногенности [171, 204, 205].
Химическая инактивация вирионов технически проста. Однако надежное подавление инфекционности нередко сопровождается существенным снижением других видов биологической активности, в том числе иммуногенности. К тому же, в ряде случаев требуется нейтрализация инактивирующих агентов.
Можно сказать, что все инактивирующие агенты в той или иной степени вызывают изменения как в нуклеиновой кислоте, так и в белковой оболочке. При этом характер изменений вирусных частиц во многом определяется природой инактивирующего агента и возбудителя.
Приготовление эффективных инактивированных вакцин из некоторых оболочечных вирусов (вирус кори, респираторно-синцитиальный и др.) оказалось трудной задачей, поскольку все оболочечные вирусы имеют сложную липопротеиновую оболочку (липидный бислой с встроенными белками), наружные белки которой играют основную роль в индукции протективного иммунитета и часто денатурируются в процессе инактивации и последующего хранения.
Изучение воздействия химических инактиваторов на эпитопы гликопротеинов вируса лихорадки долины Рифт показало, что вскоре после начального периода инактивации этиленимин мало действует на эпитопы. Бета-пропиолактон в значительной мере изменяет структуру семи эпитопов, а формальдегид частично воздействует на конфирмационную структуру большинства из них. Эпитопы всех инактивированных антигенов отличаются сниженной способностью реагировать со специфическими моноклональными антителами в случае хранения их более 6 мес [351].
Опытным путем на различных вирусах установлено, что при щадящих условиях инактивации, как правило, вначале теряется инфекционность, а затем ан- тигенность. Считается, что чем больше разница во времени между утратой этих свойств, тем перспективнее режим инактивации данного вируса.
Изучение механизма взаимодействия инактивирующих факторов с нуклеиновыми кислотами и белками вирусов, а также выяснение структурных и функциональных модификаций этих макромолекул поможет сделать выбор оптимальных условий инактивации вирусов с учетом их групповых и индивидуальных особенностей.
Первым реагентом для изготовления многих вирусных инактивированных вакцин был формальдегид. Около 50 лет назад была предложена инактивированная формалином сорбированная вакцина против ящура [ 1607], технологию изготовления которой совершенствовали в течение многих лет. На ранних этапах широкого применения такой вакцины имели место случаи неполного обезвреживания вируса ящура, что нередко приводило к вспышкам заболевания в европейских странах [60, 398]. Все это создало необходимость изыскать новые методы инактивации, обеспечивающие полную потерю инфекционных свойств вируса без снижения его антигенности, в результате чего предпочтение было отдано ацетилэтиленимину [398]. Однако в последнее время представлены новые доказательства в пользу пригодности формальдегида для приготовления безопасной противоящурной вакцины. Этому способствовало использование
фильтрованной вирусной суспензии, инактивация вируса перед добавлением ГОА и соблюдение общепринятого режима инактивации (0,04% формалина; pH 8,5; 25°С). Исключение адсорбации вируса перед добавлением формалина значительно облегчает контроль кинетики инактивации вируса, а также позволяет проводить очистку и концентрирование инактивированного вирусного антигена. При длительном хранении иммуногенность формолвакцины была выше, чем вакцины, инактивированной АЭИ [298]. Сохранность полных вирионов (1468- частиц) через 1 год (4°С) после инактивации формальдегидом глицилальдегидом и бета-пропионлоктоном соответственно составляла 30—50%, 80—90% и 10—20% [674]. Д. Солк и сотрудники, используя культуральный вирус и формалин, впервые в истории профилактики полиомиелита получили безопасную инактивированную вакцину. Фильтрованный вирус инактивировали формалином (1:4000; 37°С; pH 7,0; 12 суток). В дальнейшем, инактивированная формалином трехвалентная вакцина против полиомиелита повышенной активности была приготовлена в институте Мерье (Франция) из вируса, выращенного в культуре клеток Vero на микроносителе.
Вакцина против болезни Тешена, инактивированная бета-пропиолактоном, оказалась более иммуногенной, чем формолвакцина, полученная аналогичным образом, тогда как другие исследователи при создании инактивированных вакцин против африканской чумы лошадей и болезни Тешена отдавали предпочтение формалину [ 169].
Вирус африканской чумы лошадей инактивировали бета-пропиолактоном (30 мин, 25°С) или формалином (48 ч, 25°С). Иммуногенная активность обоих антигенов, сорбированных на гидрате окиси алюминия, была одинаковой [1077, 1205]. Бета-пропиолактон оказался эффективным средством при изготовлении инактивированных вакцин против ньюкаслской болезни и везикулярной болезни свиней [559].
Вирус гепатита А, адаптированный к культуре клеток человека, концентрировали преципитацией сульфатом аммония и инактивировали бета-пропиолактоном. Вакцина обладала выраженной антигенностью, вызывая длительную персистенцию антител у вакцинированных животных. Другие авторы при изготовлении вакцины против гепатита А вирус выращивали в культуре диплоидных клеток человека MRC-5. Очищенный и концентрированный вирус инактивировали формальдегидом, консервировали 2-феноксиэтанолом, а в качестве адъюванта добавляли ГОА. Одна доза (1 мл) вакцины, содержащая 720 ед. (ИФА) вирусного антигена, вызывала практически 100%-ную сероконверсию у взрослых, а после бустеризации обеспечивала защиту сроком не менее 10 лет [245, 1237]. Аналогичная вакцина при испытании на обезьянах и морских свинках обладала выраженной антигенностью и иммуногенностью [97]. Инактивированная вакцина против гепатита А была лицензирована в ряде европейских стран. Лицензированная вакцина 5 КВ для взрослых содержала 1,440 единиц/мл вирусного антигена (определение в стандартном ИФА), 0,5 мг. А1(ОН)3 в качесте адъюванта и 2-феноксиэтанол в качестве консерванта. Первичную иммунизацию прово
дили внутримышечно одной дозой вакцины, бустеризация — через 6—12 месяцев усиливала иммунитет. Для иммунизации детей использовали уменьшенную дозу вакцины. При ускоренном методе старения при 37°С вакцина сохраняла активность 3 недели, а при 2-8°С - 15 месяцев [1237].
Другой аналогичной лицензированной вакциной является вакцина VAQTA. Очищенный концентрированный частично аттенуированный вирус инактивировали формальдегидом и сорбировали на гидрате окиси алюминия. У вакцинированных шимпанзе в течение 2 недель развивались ВНА и они были защищены от внутривенного заражения вирулентным вирусом гепатита А. Обе инактивированные вакцины были безопасны и иммуногены для людей [245].
Инактивированную сорбированную вакцину против кори применяли трехкратно. Иммунизация сопровождалась образованием различного уровня нейтрализующих антител и антител, подавляющих ГА. Вакцинированные пациенты были защищены от заболевания в течение нескольких месяцев после иммунизации. Титр антител быстро снижался и они вновь становились чувствительными к естественному заражению [736, 1561].
Вакцину против клещевого энцефалита готовили из культурального вируса, инактивированного формалином после фильтрации, затем его очищали, концентрировали градиентным центрофугированием. Полученный препарат не обладал реактогенностью и обнаружил выраженную антигенность на добровольцах [359] и иммуногенность на мышах [631].
В производстве инактивированных антирабических вакцин наиболее часто применяют бета-пропиолактон. Высокоиммуногенным безопасным препаратом является вакцина из концентрированного и очищенного культурального вируса бешенства, инактивированного бета-пропиолактоном (в течение 18 ч при температуре 4°С, а затем 2 ч при 37°С). Такую вакцину производили в США, Франции, Германии [117]. Аналогичная инактивированная вакцина получена из очищенного вируса, выращенного в культуре клеток Vero [895]. Сорбированную вакцину против бешенства для ветеринарной практики готовили из ткани мозга инфицированных мышей, крыс или из культурального вируса. Вирус инактивировали бета-пропиолактоном.
Инактивированные вакцины против эпидемического паротита менее эффективны, чем живые. Формолвакцина вызывала образование антител к HN гликопротеину и к денатурированному F-белку и по-видимому ограничивалась индукцией IgG и слабым клеточным иммунным ответом [448].
Вирус восточного энцефаломиелита лошадей, выращенный в суспензии све- жеизолированных клеток куринного эмбриона, инактивировали формалином или бета-пропиолактоном. Наибольшим защитным эффектом для морских свинок обладала бета-пропиолактоновая вакцина [169].
Вирус геморрагической болезни кроликов, инактивированный формальдегидом, вызывал у привитых животных выраженный протективный эффект. Инактивация вируса бета-пропиолактоном сопровождалась менее выраженным снижением гемагглютинирующей активности и отчетливой иммуногенностью.
Вирус чумы крупного рогатого скота, инактивированный формальдегидом в сочетании с неполным адъювантом Фрейнда, индуцировал у крупного рогатого скота иммунитет продолжительностью один год.
Высокоиммуногенная эмульгированная вакцина получена из вируса болезни Ауески, инактивированного формальдегидом или глутаральдегидом [1530]. Не менее эффективные культуральные вакцины получены с использованием для инактивации вируса этиленимина или этилэтиленимина. По иммуногенной активности они не уступали живой вакцине против болезни Ауески [226].
Инактивированную вакцину против PC-инфекции крупного рогатого скота удалось приготовить из инфицированных вирусом клеток, обработанных глю- таральдегидом. При испытании на телятах эта вакцина оказалась более иммуногенной, чем живая вакцина из аттенуированного штамма PC-вируса крупного рогатого скота и ts-мутанта PC-вируса человека. Для изготовления вакцины против лейкоза крупного рогатого скота использовали постоянную линию клеток FLK, персистентно инфицированную этим вирусом. Клетки инактивировали формальдегидом или глютаральдегидом и добавляли адъювант. Только препарат, инактивированный формальдегидом, обладал протективным действием [744].
Инактивация вируса катаральной лихорадки овец КЛО димером этиленимина (0,04—0,06 %; 37°С; в течение 3—5 дней) позволила получить безопасный вы- сокоиммуногенный препарат. Повышение концентрации ДЭИ и продолжительности обработки вируса в 2—3 раза не снижало заметно его иммуногенности и гарантировало получение безопасного препарата, что свидетельствует о мягком инактивирующем действии ДЭИ на вирус КЛО.
Формолвакцина против артеривирусной инфекции лошадей оказалась достаточно эффективным препаратом. Выраженный иммунный статус поддерживался ревакцинацией через каждые 6 мес. [687].
Вирусы, инактивированные сернокислой медью, сохраняли антигенные и иммунногенньге свойства, а также целостность вирионной ДНК [205].
При инактивации парвовируса свиней формальдегидом гемагглютинирую- щая активность практически исчезла, тогда как при инактивации ДЭИ снижалась незначительно. Однако по антигенности препараты в обоих случаях практически не различались между собой.
Один из способов повышения безопасности инактивированных вакцин на случай неполной инактивации вируса — использование аттенуированных штаммов. Классический пример этого — изготовление инактивированных вакцин из аттенуированных штаммов вируса бешенства. Иммуногенные инактивированные вакцины были получены также из аттенуированных штаммов вируса ньюкаслской болезни, парвовирусов энтерита кошек и собак 1492], вируса болезни Ауески. Изготовление инактивированных вакцин из аттенуированных или частично аттенуированных штаммов вируса усиливает безопасность производства вакцин, что представляет большой интерес при работе с возбудителями опасных болезней.
При изготовлении инактивированных вакцин с учетом непредвиденного распространения болезней и резкого возрастания потребности в средствах специфической профилактики целесообразна разработка методов длительного хранения концентрированных вирусных антигенов при низких температурах. Создание резерва такого вирусного сырья кажется более перспективным, чем создание резерва готового продукта. Аналогичные соображения высказывались в связи с рассмотрением перспективных направлений в специфической профилактике ящура. Установлено, что инактивированная вакцина против ящура, приготовленная из вирусных концентратов, хранившихся в жидком азоте на протяжении года, обладала высокой протективной активностью [595].