Семейство флавивирусы включает 3 рода: флавивирусы, пестивирусы и гепа- цивирусы. Несмотря на то, что вирусы семейства имеют подобные геномы и сходные физико-химические свойства, они значительно различаются между собой биологически. Род флавивирусов включает более 60 вирусов, из которых около 30 связаны с членистоногими переносчиками вирусов патогенных для человека. Эти вирусы вызывают различные заболевания от эфемерной лихорадки до геморрагической лихорадки и энцефалитов. Около 10 альфавирусов патогенны для животных, вызывая малораспространенные заболевания (менингоэнце- фалит индеек, шотландский энцефалит овец, болезнь Вессельсборна). Прото- типным вирусом рода флавивирусов является вирус желтой лихорадки.
Род пестивирусы включает 4 вируса. Кроме вируса классической чумы свиней (КЧС), в него входят еще три вируса, представляющих 6 антигенных групп: 2 вируса диареи КРС (BVDV-1 и BVDV-2), 3 вируса пограничной болезни овец (BDV-1, BDV-2, BDV-3), и одну антигенную группу представляет штамм Н138, выделенный от жирафа в Кении [311]. Прототипным вирусом рода является вирус диареи КРС 1 (штамм Орегон C24V).
Род гепацивирусы представлен вирусом гепатита С (6 генотипов) и вирусами гепатитов G.
Вирионы флави- и пестивирусов имеют форму сферических частиц диаметром 40—50 нм. В центре расположен нуклеокапсид, вероятно, кубической симметрии (диаметр ~30 нм), который окружен тесноприлегающей липидной оболочкой с неразличимыми пепломерами на поверхности. Зрелые вирионы содержат 6% РНК, 66% белка, 9% углеводов и 17% липидов [1349].
Геном состоит из одной линейной молекулы одноцепочечной (+)РНК размером 10,6 (флавивирусы), 12,5 (пестивирусы) или 9,5 (гепацивирусы) тн. 5'-ко- нец, за исключением немногих флавивирусов, передающихся членистоногими,
имеет КЭП-структуру. З'-конец обычно не полиаденилирован и имеет короткий нетранслируемый участок.
Вирусный геном содержит одну длинную открытую рамку считывания, кодирующую около 10 белков, которые образуются в результате расщепления полипротеина в процессе или вскоре после трансляции.
Репликация вируса сопровождается синтезом комплиментарных (—)РНК, которые затем служат матрицей для синтеза геномной (+)РН К. Преобладающий синтез (+)РНК предполагает наличие комплекса регуляторных механизмов в клетках хозяина. Только вирусные мРНК представляют геном, транслирующийся с образованием единого полипротеина, который расщепляется с образованием структурных и неструктурных белков. Сборка вирионов происходит на мембранах эндоплазматической сети (на плазматической мембране клеток членистоногих), но наличия преформированных капсидов и почкования при этом не отмечено. Полностью сформированные вирионы появляются в цистернах эндоплазматической сети и освобождаются путем экзоцитоза или при цитолизе (без очевидного почкования) [1135].
Вирионы содержат 3 (флавивирусы) или 4 (пестивирусы) белка, которые кодируются 5'-концом генома, неструктурные белки кодируются 3'-концом генома.
Структурными белками являются: нуклеокапсидный белок С, трансмембранный белок М, который образуется из гликозилированного предшественника ргМ расщеплением в процессе вирусного созревания; и Е белок (Е1 и Е2 у пес- тивирусов) — главный пепломерный гликопротеин. Е белок (~50 кД) является главным белком оболочки, содержащим вирусные рецепторы и участвующим в слиянии вирусной и клеточной оболочек. Антитела, нейтрализующие инфекционность вируса, связываются с этим белком [765].
Развитие прочного иммунитета к альфавирусам обеспечивается наличием Е белка и, возможно, белка NS1, что сопровождается образованием анти-Е антител и цитотоксических Т-лимфоцитов [424]. Изменения в Е белке в процессе мутации могут отражаться на вирулентности вируса. Трансмембранный М белок (~26 кД) является небольшим фрагментом протеолитически-расщепленного гликозилированного предшественника М белка, который играет важную роль в созревании вируса и приобретении инфекционности. Нуклеокапсид состоит из С белка (—11 кД) и геномной РНК.
Флавивирусы кодируют синтез 7 неструктурных белков: NS1 (~46кД), NS2A (~22кД), NS2B (~14кД), NS3 (~70кД), NS4A (~16кД), NS4B (~27кД), NS5 (~103кД) (2846). В том числе РНК-зависимую полимеразу и NS3, который функционирует как геликаза и протеаза и как часть РНК-полимеразного комплекса. Белок NS3 ответственен за расщепление протеина, тогда как клеточные протеа- зы ответственены за его остановку.
Флавивирусы не очень стабильны во внешней среде и легко инактивируются нагреванием и обычными дезинфектантами. Однако вирус классической чумы свиней может неделями сохраняться в мясных продуктах, полученных от инфицированных свиней, и представлять источник распространения болезни [965, 1135].
В состав оболочки пестивирусов входят три белка El, Е2 и Ems, ответственные за антигенные и иммуногенные свойства. Иммунодоминантным белком является гликопротеин Е2. У вируса классической чумы свиней важную роль в образовании иммунитета также играет белок Erns [1575]. Организацией генома пестивирусы сходны с флавивирусами [517]. Для пестивирусов характерна пантропность и узкий хозяинный спектр.
Выраженные перекрестные иммунологические реакции характеризуют пестивирусы. Тесная антигенная связь установлена между вирусами классической чумы свиней (КЧС) и вирусом диареи крупного рогатого скота [1238]. Белки вируса пограничной болезни овец имеют много общих эпитопов с белками вируса диареи крупного рогатого скота, особенно с его нецитопатогенным биотопом [227, 616]. Данные о структурном родстве согласуются с близким генетическим родством этих вирусов [879]. Вирус пограничной болезни овец (ПБ) подобен вирусу диареи крупного рогатого скота.
Общие антигенные детерминанты у вирусов диареи и классической чумы свиней лежат в основе защиты поросят вирусом диареи от заражения вирулентным штаммом вируса чумы свиней. Кроме того, последний оказывал выраженный бустер-эффект в отношении образования ВН-антител к вирусу диареи [556].
Наиболее выраженный гуморальный ответ (IgG) наблюдали у телят на гликопротеины Е1 и Е2 вируса диареи. Нейтрализующие моноклональные антитела к вирусу диареи связывали гликопротеин Е2 [601]. В структуре Е2 этого вируса выявлено три антигенных участка, один из которых оказался высококонсервативным нейтрализующим эпитопом [366]. Только моноклональные антитела к консервативному эпитопу вируса диареи крупного рогатого скота, необходимому для его репликации, узнают все изоляты этого вируса и не реагируют с изоля- тами вирусов КЧС и ПБ [1039].
Представители рода флавивирусов размножаются хорошо и вызывают цито- патический эффект во многих культурах клеток, а также в несущих Fc рецепторы макрофагах и линиях этих клеток, в которых урожай вируса повышается в присутствии специфических антител. Вирусы также размножаются в культурах клеток комаров (линии клеток С6/36 и АР-61), но без ЦПЭ. Представители рода флавивирусов инфицируют и убивают новорожденных мышей. Пестивирусы хорошо размножаются в первичных и перевиваемых культурах клеток естественных хозяев. Размножение этих вирусов, как правило, не сопровождается ЦПЭ. В двух случаях в культуре клеток, зараженных рекомбинантным вирусом КЧС, развился цитопатаческий эффект (ЦПЭ). Субгеномная РНК из этих клеток была лишена тех же вирусных генов, что и субгеномные РНК, обнаруженные во всех известных цитопатогенных штаммов вируса КЧС. Гены, кодирующие белки Npro, С, Erns, Е1, Е2, Р7 и NS2, оказались необязательными для репликации РНК. С потерей гена NS2 геном вируса КЧС реплицировался более эффективно и вызывал ЦПЭ [1103]. Химерный вирус вакцинного штамма КС вируса КЧС, содержащий ген белка Е2 вируса диареи КРС, сохранил исходную иммуногенность и приобрел цитопатическую активность.
Вирус прикрепляется к клеткам за счет рецепторов гликопротеина Е (Е1 и Е2), проникает в клетку путем эндоцитоза и реплицируется в цитоплазме. Вирус только частично выключает нуклеиновый и белковый синтез клетки млекопита- ющего-хозяина, но не останавливает функционирование клеток членистоногих. Инфекция сопровождается пролиферацией перинуклеарных мембран.
Изучение роли структурных и неструктурных вирусных белков показало, что Е белок оболочки играет главную роль в индукции нейтрализующих антител и защитного иммунитета, что было доказано иммунизацией животных субвирус - ными компонентами и рекомбинантными белками и пассивной защитой моноклональными антителами к Е белку.
Неструктурный белок NS1, экспрессируемый на поверхности инфицированных клеток, вызывает иммунный ответ, однако его участие в создании защитного иммунитета не доказано. Иммунологическая функция других неструктурных белков, вероятно, сводится к роли мишеней для цитотоксических Т-клеток [424].
Аттенуация флавивирусов наступает, как правило, быстро и объясняется высоким уровнем мутации РНК вирусов. Например, флавивирусы передающиеся комарами, становились аттенуированными после 6 пассажей в клетках Hela [614], что объяснялось высокой скоростью мутаций и стабилизацией мутированного вируса в специфическом и гомогенном типе клеток. Применительно к вирусу желтой лихорадки считается, что основными фенотипическими признаками аттенуации являются снижение нейротропности и висцеротропности (способности вызывать гепатит), что связано с изменениями в генах кодирующими белки Е, NS1 или NS3 [424].
Вирус, выделенный от персистентно инфицированных животных, обладает фенотипическими изменениями, такими как потеря гемагглютинина, снижение нейровирулентности и термочувствительности, указывая на то, что персистентная инфекция связана с аттенуацией вирусного фенотипа, генерацией ДИЧ или изменением антигенности вируса, результатом чего является уход от иммунного контроля [614].
Вирусная диарея (ВД), или болезнь слизистых крупного рогатого скота
Вирусная диарея (ВД), или болезнь слизистых крупного рогатого скота вызывается одним вирусом. Острое течение болезни называют вирусная диарея; хроническое течение, связанное с персистентной инфекцией, называют болезнь слизистых. Заболевание крупного рогатого скота и других жвачных, характеризующееся неяркими клиническими признаками, главными из которых являются диарея и поражение слизистых оболочек желудочно-кишечного тракта. В естественных условиях к заболеванию восприимчивы также буйволы и олени.
Восприимчивы животные всех возрастов, но чаще болеют животные в возрасте 8—24 месяца. Уровень материнских антител у телят исчезает к 3—8 месяцам, и они могут быть инфицированы. Заболевание у телят может осложняться вторичными респираторными и кишечными инфекциями. Вирус патогенен для овец, коз и диких жвачных.
Вирус распространен во всем мире. Антитела к нему выявляются в сыворотке крови у 50—90% КРС. У взрослого крупного рогатого скота инфекция может протекать субклинически. Несмотря на то, что инфицирование чувствительных взрослых коров обычно имеет небольшие последствия, передача вируса плодам происходит с высокой частотой. Результат такого заражения зависит от возраста (иммунологической зрелости плода) и от штамма вируса. В большинстве случаев инфицирование плодов происходит в первые 40 дней беременности и сопровождается гибелью эмбриона, его рассасыванием, мумификацией плода или абортом. Заражение коров при осеменении может вызывать раннюю гибель эмбрионов.
Инфицирование на 80—120 дне беременности (перед развитием иммунологической компетентности плода — около 125 дней) часто сопровождается нарушениями развития, гибелью плода или рождением потомства с низкой массой тела. Телята, инфицированные трансплацентарно, остаются инфицированными на всю жизнь. Они выделяют вирус, оставаясь серонегативными.
Эмбрионы, инфицированные после 125 дней беременности, обычно выживают, у них могут быть патологические изменения. Они образуют ВНА и освобождаются от вируса.
Различают два биотипа вируса диареи крупного рогатого скота: цитопатоген- ный и нецитопатогенный (биотипы 1 и II). Все цитопатегенные и нецитопато- генные изоляты вируса ВД обладают общим антигеном, который несет основной эпитоп нейтрализации [1080]. У цитопатогенного биотипа вируса диареи крупного рогатого скота в области гена неструктурного белка р 125 обнаружена вставка, напоминающая последовательность, кодирующую убиквитин. Полагают, что она приобретается в результате рекомбинации вирусного и клеточного геномов и сообщает вирусу цитопатогенные свойства [1070].
Нецитопатогенный биотип вызывает латентную персистентную инфекцию крупного рогатого скота без образования антител, что предрасполагает к развитию тяжелого клинического заболевания после заражения цитопатогенными биотипами вируса ВД [334]. Предложена гипотеза, согласно которой для проявления клинически выраженной ВД требуется персистентная инфекция нецитопа- тогенным, а затем и цитопатогенным биотипом вируса диареи. Персистентное инфицирование нецитопатогенным биотипом происходит при первичном появлении инфекции в стаде или при трансплацетарном заражении плода до развития иммунокомпетентности (первые 125 дней стельности). Если в постнаталь- ный период жизни такие животные суперинфицируются цитопатогенными биотипами вируса, то это приводит к появлению клинически выраженной болезни, что обычно сопровождается гибелью [405, 1408].
Цитопатогенные штаммы вируса попадают в организм персистентно инфицированных животных извне или в результате превращения эндогенного неци- топатогенного биотипа вируса в цитопатогенный биотип [534, 810].
Первоначально нецитопатогенный вирус заражает плод и приводит к развитию персистентной виремии у телят. Болезнь слизистых оболочек у таких телят
может возникнуть при супериинфицировании эндогенным цитопатогенным вирусом, образовавшимся в результате мутации [406] или включения клеточных последовательностей в геном вируса в результате рекомбинации [1069]. В конечном счете генетические модификации вируса сказываются на продукции вирусного белка, который ответственен за цитопатогенность в культуре клеток и болезни слизистых у телят, которые иммуннотолерантны к нецитопатогенному биотипу вируса [1135].
Учитывая особенности биологии вируса и патогенеза болезни, одной из главных задач специфической профилактики ВД является защита плода от заражения в течение первой трети беременности [962].
Обнаружена тесная антигенная связь вируса диареи с вирусом КЧС и пограничной болезни, вероятно, за счет сходства антигенной структуры гликозиро- ванного полипептида 55 кД [1279].
Переболевание ВД сопровождается развитием иммунитета и образованием ВН-антител. Однако у некоторых животных возможны рецидивы, которые связывают с недостаточностью иммунитета.
Иммунитет с молозивом и молоком передается потомству. Специфическая профилактика ВД основана на применении живых и инактивированных вакцин.
Инактивированные вакцины лишены недостатков живых вакцин, но и создаваемый ими иммунитет менее напряженный и непродолжительный. Инактивированная вакцина через семь дней после повторного введения вызывала у телят образование ВН-антител в высоких титрах и защищала их от развития выраженной инфекции при контрольном заражении вирулентным штаммом. Вакцинация глубокостельных коров инактивированной вакциной против ВД обеспечивала создание колострального иммунитета у их потомства: пассивные антитела сохраняются на высоком уровне до 40—45-дневного возраста и обеспечивают защиту животных от экспериментального заражения [723]. Инактивированная вакцина с адъювантом при двукратном применении в дозе 2 мл с интервалом 21 день вызывала образование ВН-антител у всех вакцинированных телят и иммунитет к контрольному заражению продолжительностью 1 год [1520].
Наиболее широкое применение получили живые вакцины из аттенуированных штаммов.
Идеальные аттенуированные вакцинные штаммы, наряду с высокой иммуно- генностью, не должны проникать через плацентарный барьер и не должны вызывать состояние толерантности у новорожденных телят, иммунодепрессию и гиперчувствительность к последующему заражению вирулентным штаммом вируса [246].
Живая вакцина из аттенуированного штамма Орегон С-24 (фирма Мерьё) не вызывала каких-либо осложнений у стельных коров, создавала напряженный продолжительный иммунитет у взрослых животных после однократного внутримышечного введения. В полевых условиях через 10 дней после вакцинации новые случаи болезни не регистрировали.
Температурочувствительный аттенуированный штамм RIT 4350 получен в результате химического мутагенеза. Проверка этого штамма на иммуносупрес-
сивных телятах и стельных коровах показала его безопасность и соответствие основным требованиям, предъявляемым к вакцинным штаммам вируса диареи [976]. Попытки реизолировать вирус от привитых телят не имели успеха [389]. Вакцина из этого штамма после двукратного введения (4 lg ТЦД50) с интервалом три недели вызывала сероконверсию более чем у 90% коров независимо от предшествующего наличия ВН-антител к вирусу диареи. От привитых коров получен здоровый молодняк, свободный от антител к вирусу ВД до приема молозива. Естественного заражения вакцинированных животных не установлено [979].
Относительно применения живых вакцин против ВД существуют различные рекомендации. Некоторые авторы считают, что нетели должны быть привиты до ввода в репродуктивное стадо и не должны подвергаться вакцинации в период между 40—100-м днями стельности. Для первичной иммунизации стад, в которых ранее вакцину не применяли, желательно использовать инактивированную вакцину [419].
С целью контроля болезни, животных, как правило, вакцинируют в 6-10 месячном возрасте, когда колостральный иммунитет уменьшается или исчезает. Живые вакцины применяются широко, но вакцинация персистентно инфицированных иммунотолерантных животных может в некоторых случаях вызывать тяжелопротекающую болезнь слизистых.
В последнее время для профилактики ВД и других массовых вирусных болезней КРС во многих странах широко используют комбинированные живые и инактивированные вакцины. В России, например, в течение многих лет применяют инактивированную вакцину КОМБОВАК против шести наиболее распространенных вирусных заболеваний КРС, в том числе против ВД. Применяют также живые комбинированные вакцины против 2 и 3 вирусных заболеваний (ВД, ИРТ и ПГ-3).