В главе суммированы данные о морфофункциональных особенностях хромосом человека на разных, преимущественно ранних постимплантационных стадиях развития. Основная часть приведенных результатов вполне оригинальна, так как получена на прямых хромосомных препаратах из ворсин хориона (цитотрофобласт) или различных тканей собственно эмбриона человека. Данный метод делает реальным анализ метафазных хромосом уже через несколько часов после получения материала и позволяет избежать влияния культивирования на структурно-функциональные характеристики хромосом.
Основное внимание обращено на изучение районов ядрышковых организаторов (ЯОР) и конститутивного гетерохроматина, паттерн метилирования метафазных хромосом, особенности их морфологии и репликации на разных стадиях эмбриогенеза.
Установлено, что среднее число Ag+ЯОР на метафазную пластинку и их общая активность в эмбриональных и экстраэмбриональных (хорион) тканях не зависят от стадии эмбриогенеза. Основной причиной полиморфизма ЯОР хромосом у эмбрионов человека является комбинаторика родительских ЯО-хромосом, функциональный статус которых наследуется как стабильный признак большинством (76 %) хромосом. Вместе с тем, в период с 8 до 14 недель развития отмечается возрастание суммарной транскрипционной активности кластеров рибосомных генов, которое обусловлено большей функциональной активностью /gt;-генов хромосом группы G (21 и 22) по сравнению с хромосомами группы D (13, 14 и 15). Нельзя поэтому исключить реальное существование молекулярных механизмов репрессии — дерепрессии /gt;-генов, регулирующих их активность во время нейруляции, активного органогенеза и плацентации. Увеличение активности экспрессии р-генов отмечается на более поздних стадиях эмбриогенеза и у плодов с тяжелыми пороками развития. При нормальном кариотипе у плода изменчивость характера Ag-окраски ЯОР более свойственна хромосомам группы G. Наличие дополнительной ЯО-хромосомы в кариотипе плода сопровождается увеличением числа хромосом группы D с вариабельными ЯОР и приводит к возрастанию общей транскрипционной активности _р-генов. При трисомиях 21 и 13 изменчивость функционального статуса ЯОР не связана с происхождением ЯО-хромосом, тогда как при нормальном кариотипе у плода характер Ag-окраски сохраняется неизменным на хромосоме 15, унаследованной от матери.
Исследования с помощью двух вариантов метода ник-трансляции (предобработка ДНКазой I детектирует конформационные особенности ДНК, а предобработка хромосом рестриктазами MspI и HpaII выявляет гипометилированные участки ДНК) дали сходные результаты и позволили получить принципиально новые данные относительно расположения на метафазных хромосомах функционально активных районов в зависимости от типа ткани и стадии развития. Эти наблюдения были дополнены морфометрическим анализом размеров соответствующих гетерохроматиновых районов в клетках цитотрофобласта хориона и эмбриональных тканей.
Наиболее значимые результаты включают: различия в уровне метилирования некоторых гомологичных сегментов хромосом из клеток цитотрофобласта и из клеток эмбриональных тканей, различия в метилировании гомологичных сегментов хромосом из клеток хориона в сравнении с аналогичными сегментами хромосом из лимфоцитов взрослых, гипометилированность районов прицентромерного хроматина в клетках цитотрофобласта.
  1. Гетерологичность метилирования выражена наиболее четко для сегментов 2q11-13, 11p15 и Xq24-27 в клетках цитотрофобласта и для сегментов 15q11—13 в эмбриональных клетках. Есть основания предполагать, что именно в этих районах функционально активны гены только одного гипометилированного гомолога, контролирующие развитие хориона и плаценты (2q11—13, 11p15, Xq24-27) и дифференцировку собственно эмбриональных тканей (15q11—13). Идентичные гены тех же сегментов другого гомолога, по всей вероятности, остаются импринтированными и функционально неактивными. Уместно отметить, что именно в сегментах хромосом 11 и 15, отличающихся степенью метилирования, локализованы крупные кластеры импринтированных генов.
  2. Различия в интенсивности флуоресценции антител к 5-метилцитозину на хромосомах лимфоцитов взрослого и плода особенно характерны для сегментов 2q33, 6p11.2, 13q22. Гиперметилированность этих сегментов в лимфоцитах пуповинной крови позволяет предполагать, что гены соответствующих сегментов, скорее всего, функционально неактивны в период внутриутробного развития.
  3. Установлены существенные отличия в состоянии блоков прицен- тромерного гетерохроматина в хорионе и эмбриональных тканях — ги- пометилированность и слабая степень спирализации гетерохроматина в цитотрофобласте, гиперметилированность и высокая степень спи- рализации в эмбриональных клетках. На основании этих результатов сформулирована гипотеза о наличии в околоцентромерном хроматине хромосом 9 и 16 «ранних» генов, продукты которых необходимы для обеспечения роста хориона, формирования плаценты и их нормального функционирования. Не исключено, что в гетерохроматине локализованы гены пролиферации и клеточного роста, а также факторы их регуляции, активация и инактивация которых осуществляется путем изменения характера метилирования.

Эти результаты хорошо согласуются с данными морфометрического анализа, свидетельствующими об увеличении размеров С-блоков хромосом 1, 9 и 16 в экстраэмбриональных тканях у плодов человека в первом триместре беременности.
Определенное сходство между хорионом и опухолями в отношении параметров клеточного цикла, предрасположенности к гетероплоидии, уровню метилирования позволяет высказать предположение, что некоторые онкогены, многие из которых, как известно, играют важную роль в эмбриогенезе, активны и в клетках хориона. По крайней мере, часть таких генов локализована в гетерохроматине. Можно надеяться, что полная расшифровка первичной структуры генома человека, включая и области гетерохроматина, идентификация всех генов и выяснение их функций позволят решить проблему гетерохроматина, в том числе получить ответ на вопрос о наличии в его составе структурных генов.
Использование моноклональных антител к 5-метилцитозину позволило обнаружить и описать новый тип сегментации метафазных хромосом человека, который мы назвали М-сегментацией. Предварительные данные, полученные на зародышах человека, свидетельствуют о наличии количественных и качественных различий паттернов метилирования метафазных хромосом на разных стадиях эмбриогенеза человека. Характерным для эмбрионов ранних доимплантационных стадий является гемиметилированность хромосом. Дефинитивный рисунок метилирования хромосом начинает определяться только на стадии мо- рулы — ранней бластоцисты. У плодов 20-24 недель развития отмечаются существенные отличия паттерна метилирования многих локусов от гомологичных им локусов хромосом из лимфоцитов взрослых индивидуумов. Не исключено, что выявленные различия в характере метилирования метафазных хромосом и их гомологичных сегментов отражают существенные особенности функциональной активности генов этих сегментов на разных стадиях онтогенеза.
Полученные данные, основанные на визуальной оценке интенсивности флуоресценции, носят ориентировочный характер. Для точной оценки таких различий необходимо не только сравнение денситометрических профилей М-рисунка, но и насыщенность физических карт, а также сведения об экспрессионных профилях соответствующих клеток на разных стадиях онтогенеза.
Дальнейшие углубленные исследования особенностей паттернов метилирования метафазных хромосом в разных тканях и на разных стадиях эмбриогенеза могут дать ценную новую информацию об особенностях функции генома в эмбриогенезе человека.