Репликация (репродукция) хромосом, состоящая в воспроизведении клеткой в каждом цикле деления полного набора хромосом, происходит на молекулярном уровне и касается двух основных компонентов хромосомы — ДНК и гистонов.
Подходы к анализу репликации ДНК хромосом на цитологическом уровне, разработанные в 1970-1980-е годы, основаны на введении в пролиферирующие клетки предшественников ДНК в период синтеза (S-фазы) и изучении особенностей их включения в отдельные сегменты хромосом на стадии метафазы после завершения репродукции. Обычно в качестве модифицированного основания ДНК используют аналог тимидина — 5-бромдезоксиуридин (БДУ). Репликационный метод сегментации хромосом позволяет изучать синхронность репликации сегментов хромосом, обусловленную особенностями работы репликационного комплекса, как внутри одного клеточного цикла, так
в нескольких делениях клетки. Так, долговременная инкубация клеток с БДУ (в течение одного и более клеточных делений) используется для регистрации сестринских хроматидных обменов [64] и оценки продолжительности клеточного цикла [849]. Введение БДУ в S-периоде и регистрация результатов на стадии метафазы того же клеточного цикла позволяет изучать порядок репликации отдельных хромосом и их сегментов (получение R-, G- или С-репликационной исчерченности) [221, 320, 495]. Наиболее детальная характеристика паттерна репликации может быть получена при кратковременном (импульсном) введении БДУ в разные отрезки времени на протяжении S-периода. Регистрация участков хромосом, включивших БДУ, основана на изменениях структуры хроматина и способности к окрашиванию некоторыми флуорохромами (например, акридиновым оранжевым) или красителем Гимза после УФ-облучения. Наибольшей чувствительностью обладает иммуноцитохимический метод детекции БДУ с помощью специфических антител, которые связываются с доступными эпитопами на одно- нитевой ДНК независимо от структуры хроматина [320].
Эти цитологические подходы позволили установить основные закономерности репликации сегментов хромосом и выявить взаимосвязь процесса репликации с другими матричными процессами в хромосомах эмбрионов человека.
Хорошо известно, что R-сегменты реплицируются в ранней S-фазе, в то время как G- и С-сегменты — в поздней [474]. Показано также, что в период R/G-перехода, когда прекращается репликация R-сегментов и инициируется репликация G-сегментов, некоторые R- и G-сегменты реплицируются одновременно [276]. Этот период (средняя S-фаза) характеризуется снижением или прекращением синтеза ДНК, возможно, является контрольной точкой клеточного цикла [320]. Разделение S-фазы достаточно условно, т. к. многочисленные периоды замедления или остановки репликации ДНК указывают на существование множества перекрывающихся субфаз синтеза ДНК [196].
Тем не менее, репликация каждого сегмента в S-фазе строго упорядочена [757, 758], а последовательность репликации участков хромосом определяется их транскрипционной активностью [831]. Так, при репликации генов до R/G-перехода наблюдается их экспрессия в клетке, в то время как репликация данных локусов после R/G-перехо- да сопровождается отсутствием транскрипционной активности [351, 405, 757, 759]. При этом изменение транскрипционного статуса влияет на репликационный статус хромосомного сегмента. Время репликации сегмента может изменяться в зависимости от типа ткани, что, по-видимому, связано с транскрипционной активностью тканеспецифичных генов. Например, в лимфоцитах хромосомы 4, 5, 8 и 13 заканчивают репликацию позже, чем в фибробластах почки, в то время как хромосомы 15, 19, 20 и 22 реплицируются в лимфоцитах раньше, чем в фибробластах [419].
Несмотря на то, что инициация времени репликации в индивидуальных сегментах хромосом находится под жестким генетическим контролем, гомологичные сегменты могут реплицироваться асинхронно, т. е. с некоторым интервалом во времени [371]. Следовательно, контроль над репликацией сегмента в каждой отдельной хромосоме осуществляется более строго по сравнению с регуляцией репликации гомологичных сегментов [777]. Асинхронная репликация наиболее выражена для импринтированных локусов, которые характеризуются различным функциональным статусом хроматина в гомологичных хромосомах [575]. Так, если асинхронная репликация сегментов, содержащих импринтированные локусы, наблюдается в 40-90 % клеток в разных тканях, то для остальных сегментов этот показатель не превышает 10 % [371]. Возможно, что механизмы асинхронной репликации сегментов, содержащих импринтированные и неимпринтирован- ные локусы, могут быть различны [721].
Таким образом, время репликации, жестко взаимосвязанное с транскрипционной активностью хроматина, можно рассматривать как маркер функционального статуса сегмента хромосомы. Поэтому, изучая особенности репликации отдельных хромосомных сегментов в клетках эмбриональных и экстраэмбриональных тканей на разных сроках развития, можно косвенно оценить их роль в процессе диффе- ренцировки клеток эмбриона и хорион-аллантоидной плаценты.
Следует отметить, что при изучении порядка репликации хромосомных сегментов хромосом необходимо иметь представление о продолжительности клеточного цикла в целом и S-фазы в частности. Известно, что длительность стадий клеточного деления варьирует в разных тканях и на разных этапах онтогенеза. Например, для ранних этапов эмбриогенеза отмечена укороченная S-фаза с интенсивной репликацией ДНК, которая обеспечивается увеличенным числом сайтов инициации репликации [653]. Однако сведения о временных параметрах клеточного цикла в цитотрофобласте хориона и плаценты противоречивы. Так, при длительности М-фазы не более 1 часа общая продолжительность клеточного цикла оценивается в 15 или 36 часов, а длительность S-фазы — от 5,5 до 10-16 часов, фазы G2 — 2-4 часа [33, 903]. Кроме того, при изучении клеточного цикла в условиях in vitro следует учитывать особенности используемых методов. В частности, БДУ в высоких концентрациях способен приводить к замедлению процесса репликации вплоть до полного ее блокирования, что сопровождается изменением длительности S-фазы [64, 320, 903]. Таким образом, изучение параметров клеточного цикла представляет самостоятельный научный интерес и требует использования специальных методов.
Стратегия нашего исследования заключалась в анализе метафазных пластинок из спонтанно делящихся клеток цитотрофобласта и эмбриональных тканей, которые находились на разных стадиях клеточного цикла после 24-часовой инкубации в питательной среде, лишенной синхронизирующих агентов. При инкубировании фрагментов тканей в каждый культуральный флакон с определенной периодичностью им-
пульсно добавляли БДУ. Схема проведения экспериментов представле-
*
на на рисунке 10.34 . После фиксации материала и приготовления препаратов «прямым» методом проводили регистрацию включения БДУ в сегменты хромосом, используя моноклональные антитела к БДУ (АТ-БДУ). Поэтому наше исследование последовательности репликации, по существу, сводилось к регистрации сегментов, реплицирующихся одновременно в разные периоды времени на протяжении всего периода инкубации. Избранный нами подход не требует четкого знания о временных параметрах клеточного цикла, тем более что сведения о продолжительности отдельных его стадий в клетках цитотрофобласта, включая длительность S-фазы, согласно данным литературы значительно варьируют. Однако, используя в качестве маркера прохождения клетками одного клеточного цикла наличие в одной из сестринских хроматид БДУ [64], мы попытались уточнить продолжительность S-фазы клеточного цикла в клетках цитотрофобласта хориона.
В клетках цитотрофобласта метафазные пластинки с флуоресцентным сигналом АТ-БДУ только в одной из сестринских хроматид были получены после инкубации в течение 23 часов с добавлением БДУ на первые
*
два часа (рис. 10.35) . Следовательно, в течение 24 часов клетки прошли фазы G2, М, G1, S, G2 и снова вошли в митоз. Таким образом, с учетом литературных данных о временных параметрах фаз М и G2 можно предположить, что суммарная продолжительность фаз G1 и S в митотическом цикле клеток цитотрофобласта составляет 15-17 часов [137].
При анализе характера репликационной структуры хромосом 500 метафазных пластинок из клеток эмбриональных тканей и цитотрофобласта хориона от 5-12-недельных эмбрионов, оказалось, что они могут быть подразделены на несколько типов. После первых 6 часов инкубации в большинстве метафазных пластинок включение БДУ наблюдалось преимущественно в R-сегменты. Однако в отдельных случаях сигнал АТ-БДУ был зарегистрирован также и в единичных G- и C-сегментах. В следующие 8 часов инкубации характер репликационной исчерченности можно условно подразделить на пять типов: R-, R+G-, G-, G+C- и C-сегментация. В последние 6 часов инкубации тип сегментации соответствовал R+G-, G-, G+C- или C-рисункам [137]. Следует отметить, что при преимущественном включении БДУ в
R-сегменты флуоресцентные сигналы были представлены множест-
*
вом точек (рис. 10.36, а) . Возможно, этот феномен, характерный для ранней S-фазы, соответствует сотням репликационных вилок, равномерно распределенным внутри нуклеоплазмы интерфазного ядра [381] (рис. 10.36, б) . При включении БДУ в поздней S-фазе репли- кационный рисунок был представлен интенсивно флуоресцирующими четкими полосами, соответствующими G- и С-сегментам хромо*
сом (рис. 10.37, а) , что, возможно, отражает уменьшение числа вилок
*
репликации при увеличении их размера [381] (рис. 10.37, б) . Таким образом, характер репликационного рисунка, полученного в результате включения аналога тимидина в начале или конце S-фазы, может служить косвенным маркером времени репликации того или иного сегмента.
В подавляющем большинстве метафазных пластинок в цитотро- фобласте и реже — в клетках эмбриональных тканей наличие сигнала АТ-БДУ было зарегистрировано в гетерохроматиновых районах хромосом 1, 9, 16, 15 и 22 и в некоторых G-сегментах (14-150 на
метафазную пластинку), что свидетельствовало об одновременнос-
*
ти их репликации (рис. 10.38) . Интересно, что число и локализация
G-сегментов, реплицирующихся синхронно с гетерохроматином хромосом 1, 9, 16, существенно варьировали в зависимости от происхождения клетки и от срока развития эмбриона. Так, если в цитотро- фобласте у эмбрионов 5-7 недель развития общее число G-сегментов, реплицировавшихся одновременно с гетерохроматином достигало 150, а доля таких метафаз — 90 %, то в срок 12-13 недель эти показатели снизились более чем в два раза. В эмбриональных клетках в отличие от цитотрофобласта гетерохроматиновые районы, как правило, реплицировались изолированно, и только в 30 % эмбриональных клеток была зарегистрирована одновременная репликация гетерохроматина и G-сегментов. Сравнение репликационной структуры хромосом 1, 2, 3, 4, 5, 9, 11, 13, 14, 15, 16, 21 и 22 показало, что различия во времени репликации G-сегментов более выражены между цитотрофобластом и эмбриональными клетками у эмбрионов 5-7 недель, чем 12-13 недель развития (52 и 16 сегментов соответственно, Р lt; 0,05) [701].
Феномен тканеспецифичных и стадиоспецифичных различий во времени репликации сегментов может быть обусловлен несколькими причинами. Наиболее вероятно, что одной из них являются различия в параметрах клеточного цикла, другой — изменение транскрипционной активности генов, локализованных в изучаемых сегментах. Если исходить из постулата, что цитологической характеристикой конститутивного гетерохроматина является репликация в конце S-фазы, то есть позже по сравнению с другими сегментами хромосом [158, 610], то уменьшение реплицирующихся синхронно с гетерохроматином G-сегментов можно объяснить их более ранней репликацией. Принимая во внимание, что в G-сегментах преимущественно локализованы тканеспецифичные гены [568], нельзя исключить, что их транскрипционная активность необходима для конечных этапов формирования хорион-аллантоидной плаценты, завершающегося к 13 неделям развития [49]. Незначительное число таких «рано реплицирующихся» G-сегментов в эмбриональных клетках в срок 5-12 недель, возможно, связано с необходимостью функционирования многих генов в этот период активного органогенеза. С другой стороны, возможно, что репликация гетерохроматина в цитотрофобласте хориона начинается раньше, чем в эмбриональных клетках. Если последнее предположение справедливо, то следует признать, что в гетерохроматиновых районах, по крайней мере, некоторых хромосом локализованы гены, функционально активные только в эмбриональный период развития и именно в цитотрофобласте хориона.
Особое внимание обращали на себя различия между гомологичными хромосомами по интенсивности сигнала АТ-БДУ, вплоть до его полного отсутствия, в районах 1q12, 1p31, 1q31, 9q12, 9p21, 16q11.2, 16p12, 16q21. Вероятно, отсутствие сигнала или его слабая интенсивность, отражают различия во времени и в активности процессов репликации гомологичных районов. Эта асинхронность не зависела от тканевого происхождения клеток и наблюдалась у разных эмбрионов в 20-50 % метафазных пластинок. Таким образом, по уровню асинхронности репликации гетерохроматиновые районы и некоторые G-сегменты хромосом 1, 9 и 16 соответствовали импринтированным локусам. Наряду с гетерологичностью метилирования гомологичных хромосом, асинхронность их репликации, возможно, свидетельствует о различной функциональной значимости хромосом отцовского и материнского происхождения в эмбриогенезе человека. Однако это предположение нуждается в дополнительных специальных исследованиях.
Еще один интересный факт касается наличия клеток с разновременной репликацией гетерохроматиновых районов разных хромосом. Так, например, в цитотрофобласте на некоторых метафазных пластинках включения БДУ были зарегистрированы только в районе 16qh, в то время как в гетерохроматине хромосом 1 и 9 флуоресцентных сигналов обнаружено не было. На других метафазных пластинках БДУ содержали районы 9q12 и 16q11.2 при отсутствии сигнала в районе 1q12. При этом одновременно с гетерохроматином реплицировались некоторые G-сегменты, что характерно для начала поздней S-фазы. На некоторых метафазных пластинках одновременно с G-сегментами реплицировался только прицентромерный гетерохроматин хромосомы 1, на других — районы 1q12 и 16q11.2, в то время как в районе 9q12 включение БДУ не обнаружено. По сочетанию включения БДУ в гетерохроматиновые районы хромосом эмбриональных клеток также можно выделить несколько вариантов.
Причина этих хромосом-специфичных моделей репликации некоторых G-сегментов и гетерохроматиновых районов хромосом 1, 9 и 16 остается неясной. Скорее всего, они обусловлены различиями во времени начала и окончания репликации. Поскольку варианты сочетания одновременной репликации разных сегментов хромосом в эмбриональных клетках и цитотрофобласте различны, нельзя исключить, что они маркируют клетки разной степени дифференцировки. К сожалению, на хромосомных препаратах определить принадлежность метафазной пластинки к какому-либо типу ткани не представляется возможным. Тем не менее, на «прямых» препаратах из хориона, где нами установлено две репликационные модели, метафазные пластинки представлены только клетками Лангханса, активная пролиферация которых в I триместре необходима для образования и поддержания собственно цитотрофобласта и для дифференцировки синцитиотрофобласта, покрывающего ворсины хориона. В то же время наличие большего числа моделей репликации в клетках эмбриональных тканей вполне согласуется с активной пролиферацией и дифференцировкой клеток всех типов тканей в период органогенеза. Полученные результаты подтверждают данные о тканеспецифичности порядка репликации отдельных сегментов хромосом в разных тканях, которая была обнаружена для лимфоцитов и фибробластов человека в постнатальном периоде онтогенеза человека [158, 419].
Таким образом, различия в характере репликации районов гетерохроматина хромосом 1, 9 и 16 являются ткане- и стадиоспецифичными и подтверждают различный функциональный статус этих районов в эмбриональных и экстраэмбриональных тканях на разных стадиях эмбриогенеза человека.