MED24INfO

При любых предобработках препаратов (ДНКазой I, MspI и HpaII) флуоресцентный ник-трансляционный сигнал регистрировался во всех хромосомах, однако его интенсивность и характер распределения по сегментам различных хромосом и в клетках различного эмбрионального происхождения оказались различными.
На препаратах из эмбриональных тканей при обработке ДНКазой I
распределение сигнала было столь диффузным, что не позволяло отнес*
ти его к какому-либо определенному типу сегментации (рис. 10.11) .
Предобработки с помощью MspI и HpaII индуцировали более четкий
*
рисунок, соответствующий R-исчерченности (рис. 10.12) . Следует отметить полное отсутствие ник-трансляционного сигнала в С-сегмен- тах и единичные сигналы в районах 1qh, 9qh 16qh хромосом из эмбриональных клеток при различных предобработках препаратов.
В клетках цитотрофобласта предобработка ДНКазой приводила к диффузному распределению сигнала по хромосомам с преобладанием
в R- и особенно в Т-сегментах и прицентромерных гетерохроматино*
вых районах хромосом 1, 9, 16, 15 и 22 (рис. 10.13) , в то время как воздействие MspI и HpaII — к более четкой картине R+Т-исчерченно- сти при сохранении сигнала в районах 1qh, 9qh, 16qh, 15cenh и 22cenh (рис. 10.14) .
Обнаруженные межтканевые различия, обусловленные спецификой использованных ферментов и их различным сродством к сайтам- мишеням, отражают более глубинные различия в структурно-функциональной организации хромосом клеток эмбриона и его провизорных органов. Так, известно, что ДНК трофэктодермы в меньшей степени метилирована по сравнению с ДНК внутренней клеточной массы [646], а уровень метилирования CpG-динуклеотидов в плаценте почти в 2 раза ниже, чем в лимфоцитах взрослого человека [369]. Кроме того,

замещение цитозина на 5-метилцитозин в значительной мере влияет на структуру и стабильность хроматина и сопровождается его деконденсацией [899]. Это явление можно оценить визуально. Так, при одинаковых методических условиях приготовления «прямых» препаратов метафазные хромосомы из клеток цитотрофобласта хориона заметно менее конденсированы по сравнению с хромосомами из эмбриональных клеток — производных внутренней клеточной массы (ср. метафазные пластинки, видеоизображения которых получены при одном уве*
личении, рис. 10.11 и 10.13) . Поэтому логично, что ДНК хромосом в цитотрофобласте более доступна для нуклеаз, чем в клетках эмбрионального происхождения. Что касается неспецифического проявления сигнала, затрудняющего определение границ сегментов на хромосомах, то следует отметить, что в процессе ник-трансляции происходит репарация любых разрывов, индуцированных не только тем или иным ферментом, но и условиями приготовления препаратов. Не исключено, однако, что спонтанные однонитевые разрывы в ДНК являются свойством метафазных хромосом эмбриональных клеток. По крайней мере, множественные однонитевые разрывы обнаружены в хромосомах мышей на доимплантационных стадиях развития [697].
В какой-то мере нечеткость сегментации обусловлена и различной плотностью распределения сайтов-мишеней для эндонуклеаз, которая определяется как их распределением в первичной последовательности ДНК, так и особенностью их упаковки в процессе спирализации хромосомы.
Уместно напомнить, что специфичность распределения АТ- и CG-пар оснований ДНК в геноме хорошо коррелирует с особенностями R/G дифференциальной окраски метафазных хромосом. Так, для G-дисков характерна высокая плотность АТ-пар, тогда как R-диски богаты GC-динуклеотидами. При этом R-сегменты неоднородны и подразделяются на несколько подтипов в зависимости от распределения и плотности GC-богатых фрагментов (изохоров), а также содержания других молекулярных маркеров, например, Alu-повторов [772]. При этом наиболее GC-богатые R-сегменты, независимо от содержания в них Alu-повторов, определяют как T-сегменты [473]. Важно отметить, что плотность генов в GC-обога- щенных R-сегментах, особенно в Т-сегментах, которые относятся к активно транскрибируемому хроматину, в среднем на порядок выше, чем в АТ-богатых G-дисках [161, 258, 820].
Результаты проведенного нами анализа распределения ник-транс - ляционных сигналов по плечам хромосом наглядно иллюстрируют факты локализации в R- и Т-сегментах GC-богатых последовательностей (по расположению сайтов-мишеней для рестриктаз MspI и HpaII) и принадлежности к активному хроматину (по различной доступности для рестриктаз MspI и HpaII, обусловленной метилированием и наличием сайтов-мишеней для ДНКазы I). Так, максимальная концентрация сигнала при одном раунде амплификации регистрировалась в Т-сегментах, например, в хромосоме 7 в сегментах 7q32 и 7q36 (рис. 10.14) , в хромосоме 11 — в сегментах 11р15, 11q23 и особенно — в 11q13 (рис. 10.15) . Интересно отметить, что район 11q12-13 является «горячей точкой» рекомбинации [355]. Оба плеча хромосомы 19, в которой все R-блоки являются, по сути, Т-блоками, демонстрировали наличие сигнала, тогда как хромосома 18, которая не имеет Т-блоков, демонстрировала относительно слабое свечение. Исключениями являлись некоторые R-блоки (например, 18p11, 18q23, 9q22), интенсивность включения сигнала в которые была сопоставима с истинными Т*
блоками (рис. 10.13 и 10.14) . По-видимому, в большинстве R-сегментов плотность СрG-островков недостаточна для выявления сигнала на цитологическом уровне, хотя проявление многих R-сегментов после 2-кратной амплификации сигнала свидетельствует о том, что образование и репарация брешей («ников») происходит и в них, но с меньшей интенсивностью.
При анализе распределения участков хромосом, чувствительных к нуклеотид-специфичным эндонуклеазам, необходимо учитывать степень спирализации хромосом. Известно, что многие R- и G-сегменты на малоспирализованных хромосомах «распадаются» на субсегменты, число и относительная плотность которых варьируют в разных районах хромосом (см. главу 2). При спирализации слияние одних субсегментов в сегменты и далее в районы хромосом происходит более, других — менее интенсивно [162, 168, 176]. Эти особенности неравномерной упаковки имеют немаловажное значение при характеристике структурно-функциональных особенностей конкретных участков хромосомы.
Расшифровка генома человека и очевидные успехи в картировании генов на хромосомах предоставляют уникальную возможность проанализировать особенности генного состава участков хромосом, характеризующихся, согласно полученным данным, выраженным сигналом ник-трансляции, который соответствует активному состоянию гетерохроматина. Сравнительный анализ таких функционально активных сегментов в клетках цитотрофобласта (см. выше) указывает на то, что именно в них сосредоточены кластеры генов факторов транскрипции (PAX4, HRC1, HRAS1, SOX6, ZNF214, ZNF215, ZNF143, ZNF195, HLXB9), факторы роста (INS, IGF2, INSIG1), гены энергетического обмена (cDKNIC, NDUFA5), гены регуляторы митотической активности (RAS, REHEB2, p53, H19), гены клеточной дифференцировки, в том числе, участвующие в развитии плаценты (H19, KIP2RNH) и эмбриональной дифференцировке (SCRA1, PTJP, GBX1, MEST, SHH), а также гены малых цитоплазматических РНК (RNY1-5). Участие этих генов в контролировании процессов раннего эмбриогенеза, в том числе в развитии и становлении хориона и дефинитивной плаценты представляется вполне реальным. Таким образом, с определенными ограничениями, результаты, полученные методом ник-трансляции, вполне могут быть использованы для поиска участков хромосом, обогащенных генами, активно функционирующими в определенных клетках на соответствующих стадиях развития. Мы еще вернемся к рассмотрению этого принципиально важного положения в заключительной главе.
Характер распределения ник-трансляционных сигналов в метафазных пластинках из клеток цитотрофобласта принципиально не отличался между гомологичными хромосомами. Вместе с тем, идентичные районы некоторых гомологичных хромосом проявляли заметные отличия по интенсивности флуоресценции. Учитывая, что эти отличия могут отражать различную функциональную значимость гомологичных хромосом в эмбриогенезе [380], представляло интерес понять причину этой гетерогенности.
Сравнительный анализ гомологичных хромосом по интенсивности ник-трансляционного сигнала был предпринят на «прямых» препаратах из клеток цитотрофобласта хориона от 9 эмбрионов 8-11 недель развития. От каждого индивида исследовали по 4 метафазные пластинки с четкой R+T-сегментацией хромосом, полученной при предобработке препаратов ДНКазой! и HpaII. При визуальной оценке интенсивности сигнала в идентичных районах хромосом заметные различия регистрировали как «+», а их отсутствие — как «-». В качестве приме-

Таблица 10.3. Сравнительный анализ различий по интенсивности флуоресцентного сигнала в интервале 2qll ~ ql3 на метафазных хромосомах из клеток цитотрофобласта после ник-трансляции с предобработкой ДНКазой I

№ эмбриона	Срок развития (недель)	Кариотип плода	Различия в интенсивности ник-трансляционного сигнала
			Метафазные пластинки				Всего
			1	2	3	4	+	-
1	7	46,XX	+	+	+	+	4	0
2	8	46,XX	+	+	+	+	4	0
3	8	46,XX	+	+	+	-	3	1
4	8	46,XY	+	+	+	+	4	0
5	9	46,XY	+	+	+	-	3	1
6	10	46,XY	+	+	+	+	4	0
7	11	46,XX	+	+	+	-	3	1
8	11	46,ХХ	+	+	-	-	2	2
9	11	46,XY	+	+	+	-	3	1

ра приведен принцип оценки различий в районе 2q11—q13 (табл. 10.3). После проверки на однородность выборки с помощью таблиц сопряженности достоверность различий/сходства оценивали методом х2. Результаты сравнительного анализа по нескольким сегментам хромосом суммированы на рисунке 10.16. В большинстве случаев межклеточные различия имели случайный характер и, по-видимому, были связаны с погрешностями методик и визуальной оценки интенсивности флуоресценции (качеством препаратов, нестрогим соблюдением условий обработки ферментами и проведения реакции ник-трансляции, наличием неспецифических сигналов и т. д.). Межиндивидуальные различия по некоторым сегментам, возможно, были обусловлены различиями в сроках развития эмбрионов, однако проверка этого предположения требует увеличения выборки.
Различия по интенсивности ник-трансляционного сигнала подтвердились лишь по сегментам хромосом Х и 2. Наиболее ярко они были представлены в интервале Xq24-q27. Во всех метафазных пластинках на препаратах хориона плодов с кариотипом 46,ХХ были отмечены различия между Х-хромосомами в интенсивности флуоресценции ник-сигнала как после обработки ДНКазой1, так и HpaII (рис. 10.16). Следует отметить, что в работах других авторов различия между

Рис. 10.16. Результаты сравнительного анализа интенсивности флуоресценции ник- трансляционного сигнала между участками гомологичных хромосом в клетках ци- тотрофобласта с предобработкой ДНКазой I


Х-хромосомами на хромосомных препаратах из культивированных лимфоцитов были зарегистрированы только при изотопном варианте ник- трансляции [501], и не были обнаружены при детекции в проходящем свете [214, 851]. С помощью модифицированного варианта метода ник- трансляции in situ (метод SPRINS) были обнаружены различия в метилировании по большему числу сегментов активной и неактивной Х-хромо- сом в 57-90 % лимфоцитов от разных доноров с нормальным женским кариотипом [229]. Принимая во внимание, что район Xq24-q27 подвергается инактивации только на одной из Х-хромосом, различия в метилировании ДНК и конформации хроматина в этих участках свидетельствуют об отличиях их функционального статуса. Вместе с тем, корреляция между метилированием и активностью Х-хромосом оказывается более сложной. Так, при анализе лимфобластоидной клеточной линии, характеризующейся полисомией Х-хромосом, методом SPRINS было установлено, что активная Х-хромосома гиперметилирована по сравнению с неактивными Х-хромосомами [229]. Возможно, эти различия обусловлены наличием особого механизма выключения неактивной Х-хромосомы (см. раздел 10.2.2). Таким образом, метод флуоресцентной детекции достаточно чувствителен для выявления различий между Х-хромосомами в клетках с двумя и более Х-хромосомами, а также пригоден для анализа функциональных различий отдельных районов гомологичных аутосом.
Достоверные различия в интенсивности флуоресценции ник-трансля- ционного сигнала между аутосомными гомологами были зарегистрированы только по хромосоме 2 (район 2q11-q13). В остальных хромосомах, независимо от использованных эндонуклеаз (ДНКаза I или HpaII), различия в гомологичных районах и их отсутствие регистрировались примерно с одинаковой частотой (рис. 10.16). Можно предполагать, что район 2q11- q13, содержащий 2 R-сегмента (2q11.2 и 2q11.3) и характеризующийся высокой плотностью генов [473], функционально активен только в одной из гомологичных хромосом в клетках цитотрофобласта. Тождественный район в другом гомологе, по-видимому, остается функционально инертным. К сожалению, пока неясно, является ли функционально активным (или инертным) район 2q11-q13 одного и того же гомолога и если так, то каково родительское происхождение этой хромосомы.
Принимая во внимание известные факты неслучайной инактивации отцовской Х-хромосомы в провизорных органах (плацента, желточный мешок) мышей и, возможно, человека [588], особенности плаценты и оболочек как основного иммунологического барьера между генетически различными организмами [694], предположение о функциональной неравнозначности генов района 2q11-13 представляется вполне логичным. Однако этот феномен нуждается в дополнительных доказательствах.
Между тем, функциональная гетерогенность гомологов, доказанная для Х-хромосомы и предполагаемая, согласно полученным результатам, для района 2q11-q13, по всей видимости, носит более универсальный характер и не ограничена цитотрофобластом. Об этом, в частности, свидетельствуют данные о различиях между гомологами хромосом 11 и 15 по интенсивности ник-трансляционного сигнала, опосредованного обработкой HpaII [145]. Отличия гомологов по локусу 15q11-q13
*
наблюдались только в эмбриональных клетках (рис. 10.17) , но не в клетках цитотрофобласта. Известно, что локус 15q11-q13 содержит кластер из 10 импринтированных генов, экспрессия 9 из которых осуществляется с отцовской аллели и лишь одного — с материнской [721]. Нарушение импринтирования генов этого локуса, его делеция

или однородительская дисомия приводят к возникновению синдромов Прадера-Вилли или Ангельмана, в зависимости от того, в какой из родительских хромосом произошли изменения, или какая из хромосом представлена в двух копиях [710]. С учетом того, что только в зародышевых клетках наблюдались различия между гомологами хромосом 15, т. е. локус 15q11-q13 в одном из гомологов был гипометилирован, можно предполагать, что активное состояние сохраняют гены в этой области только на одной хромосоме, тогда как в другом гомологе они гиперметилированы и, по-видимому, функционально неактивны. Им- принтирование этого локуса свойственно только эмбриональным клеткам, но не цитотрофобласту, по крайней мере, в 5-8 недель развития.
Различия между гомологами по характеру включения сигнала наблю-
*
дались также по участку 11р15 (рис. 10.18) . Так, в клетках экстраэмбриональных тканей гипометилированный локус находился лишь на одном из гомологов, в то время как в эмбриональных клетках этот участок оказался гипометилированным на обоих гомологах. Следовательно, локус 11р15, возможно, импринтирован только в клетках внезародышевых тканей. Интересно отметить, что этот локус хромосомы 11 содержит кластер из семи импринтированных генов, для шести из которых характерна экспрессия материнских аллелей и для одного — отцовской [721].