Как упоминалось выше, при любых предобработках препаратов перед проведением ник-трансляции, наряду с сегментацией, соответствующей стандартной R/Т-исчерченности, яркий флуоресцентный сигнал определялся в районах прицентромерного гетерохроматина хромосом 1, 9, 16 в клетках цитотрофобласта и практически отсутствовал
*
в клетках эмбриональных тканей (рис. 10.19) . В аналогичных работах, выполненных на лимфоцитах периферической крови в постнатальном периоде, а также на клетках лимфобластоидной линии ник-трансляци- онного сигнала в блоках конститутивного гетерохроматина не наблюдалось [214, 851].
Наличие в прицентромерном гетерохроматине ник-трансляцион- ного сигнала, опосредованного метилчувствительной рестриктазой НраЛ, свидетельствует о том, что районы конститутивного гетерохроматина 1qh, 16qh и, в особенности, 9qh гипометилированы в цитотро- фобласте по сравнению с эмбриональными тканями. Гипометилиро- ванность ДНК в составе гетерохроматина хромосомы 9 (сегмент 9q12) в плаценте человека и в активно пролиферирующих опухолевых клетках ранее отмечалась в работах других авторов [336, 416]. Феномен гипометилированного состояния гетерохроматина хромосом 1 и 16 в цито- трофобласте хориона зарегистрирован нами впервые [135, 558].
Гипометилированность районов конститутивного гетерохроматина при злокачественных новообразованиях можно считать доказанной. Так, в клетках аденокарциномы молочной железы гипометилирован гетерохроматин хромосомы 1 [494], в лимфобластоидных клетках и клетках опухолей Вильмса гипометилированы районы 1q12 и 16q11 [491, 776]. Известно также, что хорион человека, состоящий из трофэк- тодермы, внезародышевой эктодермы и внезародышевой мезодермы, представляет собой активно пролиферирующую и бурно дифференцирующуюся ткань ^м. главу 1). Пролиферация и дифференцировка особенно интенсивны в цитотрофобласте хориона, который представляет собой камбиальный слой синцитиотрофобласта, обеспечивающий трофику зародыша. Индекс пролиферативного потенциала хориона до 13-й недели развития соответствует таковому для некоторых злокачественных опухолей [734]. Вероятно, механизмы, обеспечивающие интенсивную пролиферацию малигнизированных клеток и нормальных клеток хориона весьма схожи или даже идентичны. Не исключено, что в гетерохроматине локализованы гены пролиферации и клеточного роста, а также факторы их регуляции, активация и инактивация которых осуществляется путем изменения характера метилирования. Предположения о наличии в гетерохроматине эмбриоспецифичных структурных генов, контролирующих ранние стадии эмбриогенеза человека, высказывались и ранее [158, 385]. Однако локализация в гетерохроматине необходимых для раннего развития генетических элементов (ранних генов), активных до начала функционирования эухроматинового генома эмбриона, показана только у дрозофилы [712] и у пашенной полевки [807]. К сожалению, технологии секвенирования, позволившие провести расшифровку 98 % генома человека, не позволили установить первичную последовательность нуклеотидов участков ДНК, входящих в состав конститутивного гетерохроматина. Поэтому вопрос о наличии в них структурных генов остается по-прежнему открытым.
Известно, однако, что в состав прицентромерного гетерохроматина, кроме АТ-богатой альфа-сателлитной ДНК, входят три класса сател- литной ДНК, различающихся по насыщенности CG-нуклеотидами и предпочтительному распределению по хромосомам. Так, обогащенные АТ-парами повторяющиеся последовательности сатДНЮ преимущественно локализованы в гетерохроматине хромосом 3 и 4, коротких плеч хромосом групп D и G, а также в длинном плече Y-хромосомы. Имеющие и АТ- и CG- пары сатДНКП и Ш также имеют хромосом-специфичное распределение — сатДНКЛ в районах 1qh и 16qh, сатДНКШ—в районе 9qh, прицентромерном гетерохроматине коротких плеч акроцентрических хромосом и Y-хромосоме [485, 610]. Известно также, что сатДНКШ хромосомы 9 состоит из пентамеров, 5-15 % которых содержат CpG-последовательности [523]. Именно эти сатДНК, в которых могут быть локализованы регуляторные CpG-последовательности структурных генов, и оказываются гипометилированными в экстраэмбриональных тканях. Возможно, экспрессия этих генов необходима для формирования дефинитивной хорион-аллантоидной плаценты.
У двух эмбрионов 6 недель развития после обработки HpaII в цитот- рофобласте сигнал был обнаружен в гетерохроматине только в одной из хромосом 1, в то время как после обработки MspI сигнал в 1q12 — зарегистрирован в обеих хромосомах [135]. Следовательно, сайты-мишени CCGG в 1q12 только в одной из гомологичных хромосом находились в деметилированном состоянии, тогда как в другом гомологе этот район был метилирован и, по-видимому, функционально неактивен. На более поздних сроках развития (7-8 недель) при такой же предобработке хромосом сигнал детектировался в районах прицентромерного гетерохроматина обоих гомологов хромосом 1, 9, 16. Можно предполагать, что до 6-й недели развития в клетках хориона функциональную нагрузку несет район 1q12 лишь одного из гомологов, а после 6 недель функционируют обе хромосомы. На этих же сроках беременности, но в эмбриональных тканях прицентромерный гетерохроматин гиперметилирован и, возможно, функционально инертен. Нельзя исключить, что отмеченные различия между гомологами в клетках цитотрофобласта обусловлены разной функциональной значимостью гетерохроматина родительских хромосом в развитии хориона и плаценты. Однако никаких доказательств в пользу этого предположения пока не получено.
*
в клетках эмбриональных тканей (рис. 10.19) . В аналогичных работах, выполненных на лимфоцитах периферической крови в постнатальном периоде, а также на клетках лимфобластоидной линии ник-трансляци- онного сигнала в блоках конститутивного гетерохроматина не наблюдалось [214, 851].
Наличие в прицентромерном гетерохроматине ник-трансляцион- ного сигнала, опосредованного метилчувствительной рестриктазой НраЛ, свидетельствует о том, что районы конститутивного гетерохроматина 1qh, 16qh и, в особенности, 9qh гипометилированы в цитотро- фобласте по сравнению с эмбриональными тканями. Гипометилиро- ванность ДНК в составе гетерохроматина хромосомы 9 (сегмент 9q12) в плаценте человека и в активно пролиферирующих опухолевых клетках ранее отмечалась в работах других авторов [336, 416]. Феномен гипометилированного состояния гетерохроматина хромосом 1 и 16 в цито- трофобласте хориона зарегистрирован нами впервые [135, 558].
Гипометилированность районов конститутивного гетерохроматина при злокачественных новообразованиях можно считать доказанной. Так, в клетках аденокарциномы молочной железы гипометилирован гетерохроматин хромосомы 1 [494], в лимфобластоидных клетках и клетках опухолей Вильмса гипометилированы районы 1q12 и 16q11 [491, 776]. Известно также, что хорион человека, состоящий из трофэк- тодермы, внезародышевой эктодермы и внезародышевой мезодермы, представляет собой активно пролиферирующую и бурно дифференцирующуюся ткань ^м. главу 1). Пролиферация и дифференцировка особенно интенсивны в цитотрофобласте хориона, который представляет собой камбиальный слой синцитиотрофобласта, обеспечивающий трофику зародыша. Индекс пролиферативного потенциала хориона до 13-й недели развития соответствует таковому для некоторых злокачественных опухолей [734]. Вероятно, механизмы, обеспечивающие интенсивную пролиферацию малигнизированных клеток и нормальных клеток хориона весьма схожи или даже идентичны. Не исключено, что в гетерохроматине локализованы гены пролиферации и клеточного роста, а также факторы их регуляции, активация и инактивация которых осуществляется путем изменения характера метилирования. Предположения о наличии в гетерохроматине эмбриоспецифичных структурных генов, контролирующих ранние стадии эмбриогенеза человека, высказывались и ранее [158, 385]. Однако локализация в гетерохроматине необходимых для раннего развития генетических элементов (ранних генов), активных до начала функционирования эухроматинового генома эмбриона, показана только у дрозофилы [712] и у пашенной полевки [807]. К сожалению, технологии секвенирования, позволившие провести расшифровку 98 % генома человека, не позволили установить первичную последовательность нуклеотидов участков ДНК, входящих в состав конститутивного гетерохроматина. Поэтому вопрос о наличии в них структурных генов остается по-прежнему открытым.
Известно, однако, что в состав прицентромерного гетерохроматина, кроме АТ-богатой альфа-сателлитной ДНК, входят три класса сател- литной ДНК, различающихся по насыщенности CG-нуклеотидами и предпочтительному распределению по хромосомам. Так, обогащенные АТ-парами повторяющиеся последовательности сатДНЮ преимущественно локализованы в гетерохроматине хромосом 3 и 4, коротких плеч хромосом групп D и G, а также в длинном плече Y-хромосомы. Имеющие и АТ- и CG- пары сатДНКП и Ш также имеют хромосом-специфичное распределение — сатДНКЛ в районах 1qh и 16qh, сатДНКШ—в районе 9qh, прицентромерном гетерохроматине коротких плеч акроцентрических хромосом и Y-хромосоме [485, 610]. Известно также, что сатДНКШ хромосомы 9 состоит из пентамеров, 5-15 % которых содержат CpG-последовательности [523]. Именно эти сатДНК, в которых могут быть локализованы регуляторные CpG-последовательности структурных генов, и оказываются гипометилированными в экстраэмбриональных тканях. Возможно, экспрессия этих генов необходима для формирования дефинитивной хорион-аллантоидной плаценты.
У двух эмбрионов 6 недель развития после обработки HpaII в цитот- рофобласте сигнал был обнаружен в гетерохроматине только в одной из хромосом 1, в то время как после обработки MspI сигнал в 1q12 — зарегистрирован в обеих хромосомах [135]. Следовательно, сайты-мишени CCGG в 1q12 только в одной из гомологичных хромосом находились в деметилированном состоянии, тогда как в другом гомологе этот район был метилирован и, по-видимому, функционально неактивен. На более поздних сроках развития (7-8 недель) при такой же предобработке хромосом сигнал детектировался в районах прицентромерного гетерохроматина обоих гомологов хромосом 1, 9, 16. Можно предполагать, что до 6-й недели развития в клетках хориона функциональную нагрузку несет район 1q12 лишь одного из гомологов, а после 6 недель функционируют обе хромосомы. На этих же сроках беременности, но в эмбриональных тканях прицентромерный гетерохроматин гиперметилирован и, возможно, функционально инертен. Нельзя исключить, что отмеченные различия между гомологами в клетках цитотрофобласта обусловлены разной функциональной значимостью гетерохроматина родительских хромосом в развитии хориона и плаценты. Однако никаких доказательств в пользу этого предположения пока не получено.