Известно, что активный хроматин, где находятся работающие и, следовательно, деметилированные гены, чувствителен к рестрикции ферментом ДНКазой I [501]. Показано, что основное количество гиперчувствительных к ДНКазе I сайтов (DH-сайтов) локализовано в 5’-концах тканеспецифичных генов, где располагаются регуляторные последовательности, включая CpG-островки [555]. Специфическая конформация хроматина, определяющая чувствительность активных или потенциально активных генов к ДНКазе I, сохраняется и в фиксированных митотических хромосомах, что впервые было продемонстрировано на примере различий в чувствительности к ДНКазе I активной и инактивированной Х-хромосом [501]. При обработке in situ препаратов метафазных хромосом ДНКазой I в местах скопления активных генов в цепочке ДНК образуются бреши (ники), которые затем в присутствии ДНК-полимеразы 1 и набора меченых нуклеотидов, репарируются и могут быть визуализированы. Распределение ник-трансляционного сигнала по длине метафазных хромосом (D-рисунок) в целом совпадает с типичным рисунком R-дисков метафазных хромосом [593].
Следует отметить, что метод ник-трансляции in situ без предварительных обработок нуклеазами позволяет выявить на метафазных хро
мосомах спонтанные однонитевые разрывы в ДНК. Так, множественные однонитевые разрывы были обнаружены в хромосомах мышей на доимплантационных стадиях эмбриогенеза [697], а также в различных клетках при апоптозе [329, 906].
Попытки использования специфических эндонуклеаз рестрикции в цитогенетической практике, предпринятые в 1980-1990-е годы [875], оказались вполне успешными для изучения нуклеотидного состава ДНК в различных участках хромосом. Так, рестриктазы, имеющие сайты-мишени, обогащенные С- и G-нуклеотидами, индуцируют, в основном, G-подобный рисунок [623], а рестриктазы, сайты-мишени которых обогащены А- и Т-основаниями — R-подобный рисунок [877]. Однако ДНК не во всех участках хромосомы равно доступна для действия рестриктаз [841]. На рестрикцию in situ влияют как структура ферментов, так и структура хроматина [367]. Некоторые рестриктазы (например, TaqI), сайты-мишени которых локализованы преимущественно в сателлитной ДНК, могут экстрагировать ДНК из таких очень компактизованных районов как С-блоки в хромосомах 1, 9, 16 и Y [330, 581]. Другие рестриктазы, например, AluI, наоборот, особенно интенсивно экстрагируют ДНК из плеч хромосом, индуцируя С-рисунок [397].
В плане локализации функционально активных участков хромосом особый интерес представляют эндонуклеазы, обладающие различной чувствительностью к сайтам ДНК в зависимости от того, являются ли те метилированными (неактивными) или неметилированными (активными).
Так, эндонуклеазы MspI и HpaII расщепляют один и тот же сайт ДНК — C^CGG, то есть являются изошизомерами. Метилирование этого сайта не влияет на рестрикционные свойства эндонуклеазы MspI, тогда как эндонуклеаза HpaII расщепляет этот сайт только в том случае, если внутренний цитозин неметилирован. С помощью именно этих рестриктаз на изолированной ДНК человека было показано, что число неметилированных CCGG-сайтов примерно в 4 раза меньше, чем всех CCGG-сайтов [523].
Доступность сайтов-мишеней для рестриктаз, особенно HpaII, осложняется вследствие связывания ДНК с белками, в том числе с метил- цитозин-специфическими белками [214], а также наличием в R-дисках Alu-повторов с высоким содержанием метилированных CpG-динуклеотидов [809]. Однако именно эти сайты, будучи в составе активного хроматина, подвергаются рестрикции HpaII и MspI, что позволяет после проведения ник-трансляции регистрировать образованные ими бреши в виде дифференциальной исчерченности метафазных хромосом. Поскольку наибольшее количество сайтов-мишеней для этих рестрик- таз находится в CpG-островках генов «домашнего хозяйства», которые локализованы в R-дисках [336], то ник-трансляция с использованием рестриктаз MspI или HpaII на хромосомах лимфоцитов человека позволяет получить дифференциальную исчерченность, подобную R-рисунку [214, 851]. Различная доступность этих сайтов для HpaII и MspI, обусловленная статусом их метилирования, определяет разное число разрывов, вносимых этими рестриктазами, в одних и тех же участках метафазных хромосом. Сопоставление этих различий позволяет судить о степени метилирования отдельных участков хромосом.
Таким образом, метод ник-трансляции in situ с использованием различных эндонуклеаз открывает широкие возможности для изучения структурной и функциональной организации хромосом млекопитающих и человека.
В нашей работе впервые использован этот метод для изучения распределения активных и потенциально активных участков хромосом на препаратах из спонтанно делящихся клеток цитотрофобласта, а также из эмбриональных тканей (эпителий кишечника, почки, легкие, роговица глаза и др.), полученных при медицинских абортах в срок 5-12 недель развития.
Согласно литературным данным, на препаратах хромосом культивированных лимфоцитов человека после ник-трансляции с использованием рестриктаз HpaII и MspI [214, 851] или следовых количеств ДНКазы1 [501, 593], сигнал регистрируется преимущественно в R-дисках и в активной Х-хромосоме. Ориентируясь на эти данные, ключевыми моментами при адаптации метода ник-трансляции для анализа «прямых» препаратов было создание оптимальных условий для получения специфического сигнала в R-дисках на аутосомах и в длинных плечах Х-хромосом.
При подборе методических условий нами была апробирована амплификация ник-трансляционного сигнала методом «иммунных сэндвичей» [713], 1-2 раунда которой позволили значительно повысить эффективность выявления сегментации. Этот метод достаточно популярен при проведении FISH, однако для детекции сигнала при ник- трансляции он был применен нами впервые.
Оптимальные условия предобработок препаратов, проведения реакции ник-трансляции, опосредованной ДНКазой! и эндонуклеазами рестрикции HpaII и MspI приведены в Приложении.