Особый интерес представляет исследование статуса метилирования метафазных хромосом у эмбрионов человека ранних стадий развития. С этой целью нами предпринят анализ М-сегментации хромосом у дробящихся зародышей, полученных по программам экстракорпорального оплодотворения. Все эмбрионы после регистрации трех пронуклеусов были признаны непригодными для трансплантации.
Прежде всего, следует отметить нечеткость М-сегментации
*
(рис. 10.27-10.31) , которая, по-видимому, обусловлена не столько условиями приготовления препаратов из дробящихся зародышей, сколько особенностями метилирования хромосом на этих стадиях развития. В целом, типичными для хромосом 2-8-клеточных эмбрионов оказались невысокая интенсивность флуоресценции и наличие гемиметилирования (метилирование только одной хроматиды). При этом большинство хромосом в бластомерах имели точечные сигналы АТ-МеС, и лишь некоторые — ярко выраженные М-сегменты. Вероятно, наблюдаемая картина отражает активно происходящие процессы деметилирования на этих стадиях развития.
Первые М-сегменты появляются на отдельных хромосомах, начи-
*
ная со стадии 8 бластомеров (рис. 10.31) и становятся характерными для большинства хромосом на стадии бластоцисты. М-рисунок хромосом на стадии бластоцисты тождественен или приближается к таковому в лимфоцитах пуповинной крови. Однако данный вывод требует более строгих экспериментальных подтверждений.
Гемиметилирование четко определяется в отдельных хромосомах, начиная со стадии двух бластомеров и, вероятно, обусловлено пассивным деметилированием, т. е. отсутствием метилирования в дочерней хроматиде. Наличие гемиметилированных хромосом на ранних стадиях дробления ранее было описано у зародышей мышей [307] и круп
ного рогатого скота [325]. В то же время у зародышей кроликов и овец процессы деметилирования генома происходят с задержкой на 2-3 деления дробления [671, 902].
У эмбрионов на стадии морулы, когда активизируется процесс метилирования de novo, выявлены хромосомы, в которых одна хроматида
*
была полностью, а другая лишь частично метилирована (рис. 10.29) . Характерными для отдельных гемиметилированных хромосом были
и сестринские хроматидные обмены, то есть обмены метилированными
*
и неметилированными сегментами сестринских хроматид (рис. 10.27) . Ранее сестринские хроматидные обмены были зарегистрированы при культивировании дробящихся зародышей мышей в среде с добавлением бромдезоксиуридина [143], а сравнительно недавно были обнаружены и у других млекопитающих при использовании АТ-МеС [307].
Особый интерес представляло сравнение паттернов метилирования гомологичных хромосом у эмбрионов на доимплантационных стадиях развития. При полной идентичности QFH-рисунка всех гомологичных хромосом в различных клетках некоторые хромосомы в бластомерах резко отличались по интенсивности флуоресценции АТ-МеС. Например, два гомолога из триады хромосом 17 оказались гипометилированными, тогда как в одном гомологе М-сегментация выявлялась уже
*
на стадии 8 бластомеров (рис. 10.29) . Учитывая, что у триплоидных зародышей человека, возникающих в условиях in vitro преимущественно вследствие диспермного оплодотворения, удвоены хромосомы отцовского происхождения, именно они, скорее всего, и оставались гипометилированными по сравнению с хромосомой материнского происхождения. Заметные отличия статуса метилирования определяются
и для гомологов других хромосом в метафазных пластинках трипло-
*
идных 8-бластомерных зародышей (рис. 10.30) . Асинхронность метилирования гомологов, по-видимому, отражает исходные различия в состоянии метилирования хромосом мужского и женского пронуклеусов [902]. Деметилирование отцовского генома у мышей, свиней, а по некоторым данным, и у человека происходит уже на стадии пронуклеусов, тогда как хромосом ооцита — только во время делений дробления [671]. По-видимому, именно отцовские хромосомы остаются гипометилированными и во время первых делений дробления у триплоидных зародышей андрогенетического происхождения. Учитывая большое значение процессов метилирования для функциональной активности генов, этот феномен требует более строгих экспериментальных доказательств. В частности, особенно важным представляется сравнение статуса метилирования гомологов разного родительского происхождения и его сопоставление с данными о функциональной активности генов, локализованных в этих хромосомах. Известно, что у доимплантационных зародышей мышей экспрессируется около 10 000 генов, многие из которых (примерно 4 %) активны только на этих ранних стадиях развития [564]. В каких хромосомах человека локализованы «ранние» гены, как их активность коррелирует с состоянием метилирования, зависит ли она от родительского происхождения остается неизвестным и заслуживает серьезных дополнительных исследований.
Не менее интересным, а в функциональном значении и более загадочным, является гипометилированное состояние прицентромерных гетерохроматиновых блоков хромосом 1, 9 и 16, которое сохранялось вплоть до стадии бластоцисты. Как уже упоминалось выше, гипометилированные блоки конститутивного гетерохроматина являются характерной особенностью хромосом цитотрофобласта хориона. Вместе с тем, в клетках других тканей у эмбрионов в 5-12 недель развития, а также в цитотрофобласте плаценты и лимфоцитах пуповинной крови (второй триместр беременности) районы 1qh, 9qh и 16qh обнаруживали интенсивную флуоресценцию АТ-5МеС, что свидетельствовало
*
об их гиперметилированном состоянии (рис. 10.32) . Следовательно, паттерн метилирования гетерохроматина варьирует в зависимости от стадии развития.
Если гипометилированное состояние является характерным свойством гетерохроматина хромосом 1, 9, 16 и Y мужского пронуклеуса [493], то имеет ли функциональное значение гипометилирование конститутивного гетерохроматина в женском пронуклеусе, или оно является простым следствием глобального деметилирования генома на этой стадии развития? Почему деметилированное состояние гетерохроматина обоих гомологов характерно для хромосом цитотро- фобласта на протяжении I триместра и меняется на метилированное в плодный период? На какой стадии начинается метилирование этих блоков в плаценте? Почему те же гетерохроматиновые блоки на обоих гомологах оказываются метилированными у эмбрионов в период ак
тивного органогенеза? Что реально стоит за этим феноменом? Эти и другие вопросы остаются пока без ответа и заслуживают дальнейшего изучения.
Считается, что районы прицентромерного гетерохроматина не содержат структурных генов и не участвуют в процессах транскрипции. Вместе с тем, предположения об участии этих районов в регуляции работы ближайших к ним генов, контролирующих ранние стадии развития у человека [134, 637, 878] получают многочисленные подтверждения. Не исключено, что именно в них находятся блоки транспозонов, а также повторяющихся последовательностей, продукты которых, как было недавно установлено, играют важную роль в обеспечении функциональной активности генов на начальных стадиях эмбриогенеза млекопитающих [760].
Следует обратить внимание на то, что наши исследования были проведены на триплоидных эмбрионах доимплантационных стадий развития. Отражают ли данные, полученные на триплоидных зародышах, реальную динамику процессов метилирования/деметилирования хромосом у нормальных диплоидных зародышей человека остается неизвестным. Существенно подчеркнуть, что развитие триплоидных зародышей человека происходит медленнее, чем зародышей с нормальным кариотипом; они имеют пониженную жизнеспособность и для них характерны множественные врожденные пороки. Однако некоторые триплоидные эмбрионы сохраняют способность не только к имплантации и внутриутробному развитию, но и к живорождению. Возможно, что метилирование как один из механизмов регуляции раннего развития человека, способно компенсировать хромосомный дисбаланс путем инактивации дополнительного хромосомного материала, по крайней мере, в отдельных районах хромосом, возможно, наиболее значимых для определенного этапа эмбрионального развития, как это было показано нами на примере трисомии 13 и 16 [145].
Гипометилирование генома бластомеров дробящихся зародышей, асимметричность рисунка метилирования (гемиметилирование) хромосом при первых делениях дробления, сменяющаяся типичной картиной М-сегментации хромосом на стадии морулы — бластоцисты, сестринские обмены, регистрируемые на гемиметилированных хромосомах — все эти особенности метилирования у доимплантационных зародышей человека описаны нами впервые [125]. Ранее эти особенности паттерна метилирования были отмечены у зародышей ранних стадий развития других млекопитающих [260, 307, 516, 902]. В наших исследованиях обнаружены, по крайней мере, две особенности метилирования хромосом человека, ранее не отмеченные у других млекопитающих: существенные различия в метилировании гомологичных хромосом и отсутствие метилирования блоков гетерохроматина хромосом 1, 9, 16 независимо от их родительского происхождения.
Таким образом, паттерн метилирования метафазных хромосом зародышей человека доимплантационных стадий развития имеет ряд важных особенностей, отличающих его от такового у эмбрионов и плодов человека более поздних стадий развития. В этой связи особый интерес приобретают исследования особенностей метилирования метафазных хромосом эмбриональных стволовых клеток человека, получаемых при культивировании бластоцисты [149]. В какой мере хромосомы эмбриональных стволовых клеток сохраняют статус метилирования, свойственный доимплантационным зародышам является предметом наших дальнейших исследований.
В заключение уместно напомнить, что иммуноцитохимический метод с использованием специфических антител не позволяет судить о метилировании, то есть о функциональном состоянии единичных генов и позволяет выявлять только сравнительно крупные фрагменты хромосом с высокой концентрацией метилированных CpG-динуклеотидов. Более четкая информация о паттерне функциональной активности хромосом в эмбриогенезе человека, в том числе при клеточной и тканевой дифференцировке может быть получена только в условиях комплексных цитогенетических, молекулярных и биохимических исследований зародышей ранних стадий развития.