В середине 1960-х годов было установлено, что часть клеток амниотической жидкости (КАЖ) способна к пролиферации и образованию колоний in vitro [814]. Несколько позднее АЖ, а также КАЖ стали использовать для биохимической диагностики некоторых заболеваний обмена веществ [659], а также для биохимической и молекулярной диагностики моногенных заболеваний [14].
Амниоцентез в целях пренатального кариотипирования обычно выполняют в период с 15-й по 17-ю неделю беременности. При амнио- центезе извлекается 20-50 мл АЖ, что составляет около 10-15 % ее общего объема [736]. Количество жизнеспособных КАЖ в таком объеме вполне достаточно для успешного культивирования. Незначительное число послеоперационных осложнений способствовало широкому внедрению амниоцентеза в практику. В настоящее время в зарубежных странах трансабдоминальный амниоцентез является ведущим среди других инвазивных методов получения образцов плодного материала.
С повышением разрешающей способности ультразвуковых аппаратов появились возможности получения АЖ в 9-14 недель беременности. Учитывая небольшой общий объем АЖ и малое число жизнеспособных КАЖ, ранний амниоцентез для кариотипирования плода используется редко [25]. С целью увеличения КАЖ предложен метод амниофильтрации, при котором из образца АЖ в I триместре беременности извлекают только клетки, а саму АЖ возвращают в амниотическую полость [426]. Однако невысокая эффективность цитогенетической диагностики ранних амниоцитов (70-95 %) при высоком риске отдаленных негативных последствий раннего амниоцентеза, в частности, маловодия, заставляют с осторожностью относиться к его внедрению в клиническую практику [477].
Как уже отмечалось, состав КАЖ очень полиморфный. Точная идентификация типов клеток, дающих клональный рост, весьма затруднена (рис. 4.18). Оптимальным для цитогенетических исследований является амниотический эпителий — активно пролиферирующий клон клеток, специфический для данной культуры [67].
Несмотря на широкое использование культур КАЖ, не существует единой методики для получения из них хромосомных препаратов. Стандартное культивирование КАЖ включает следующие этапы: постановку культуры, субкультивирование, гипотоническую обработку и фиксацию. Для анализа культивированных КАЖ используют два основных подхода [749]:
Flask-метод — культивирование клеток во флаконах и фиксация суспензии монослойной культуры после трипсинизации. Анализ проводят в двух из трех культур (по 10 метафаз для каждого образца). Если во всех метафазах наблюдается одинаковый кариотип, диагноз считается установленным. В случае обнаружения единичной метафазы с аберрантным кариотипом (числовым или структурным), анализируется резервная третья культура. Если одна и та же хромосомная аберрация определяется в более чем одной метафазе из одного флакона, но не подтверждается в остальных флаконах, устанавливается диагноз «псевдомозаицизм». В случае обнаружения одной и той же хромосомной аномалии в более чем одном флаконе, устанавливается диагноз «истинный мозаицизм».
Метод in situ — культивирование и фиксация клеток на покров-
ных стеклах в чашках Петри или в специальных флаконах-слайдах (рис. 4.19). Анализ проводят на метафазных пластинках из трех культуральных чашек или флаконов (всего анализируют 10 колоний). При выявлении аномального клона анализируют все культуры. Хромосомная аберрация, найденная лишь в одном культуральном флаконе/чаш- ке, свидетельствует о «псевдомозаицизме», в более чем одном — об истинном мозаицизме.
Эти методы требуют культивирования с несколькими пассажами и занимают в среднем 2-3 недели. К недостаткам можно отнести высокую стоимость культуральных питательных сред и оборудования, что немаловажно для отечественных лабораторий, а также высокую (до 2 %) вероятность ошибочного заключения о кариотипе плода вследствие контаминации образца клетками материнского происхождения [290].
В последние годы разработан принципиально новый подход к анализу хромосом из культивированных клеток. Метод «pipett» основан на микроманипуляционной изоляции метафазных и про-
метафазных клеток из несуспензионных культур благодаря их морфологическим особенностям и ослаблению связи с субстратом [34, 313, 739]. Дальнейшая гипотоническая обработка и фиксация проводятся с единичными клетками. Этот способ позволяет сократить период культивирования до нескольких дней и, что особенно существенно, снизить риск диагностических ошибок, обусловленных как мозаицизмом, так и контаминацией образца. Получение прометафазных и метафазных пластинок таким способом возможно из любых первичных и перевиваемых культур [166]. К сожалению, дорогостоящее оборудование и трудоемкость препятствуют широкому внедрению этого прогрессивного метода в клиническую практику.
Неудачи кариотипирования по КАЖ во многом обусловлены качеством реактивов (питательные среды, сыворотки, стимуляторы роста клеток) и недостатком опыта работы по культивированию вялорастущих клеток [67].
Следует также отметить, что в случае беременности плодом женского пола при наличии только культур КАЖ невозможно установить число ошибочных диагнозов, обусловленных контаминацией материнскими клетками. Обычно частота таких ошибок при культивировании КАЖ составляет 0,16 %, а при при культивировании клеток ворсин хориона она может достигать 0,4 % [334, 896].
Учитывая высокую эффективность кариотипирования плода на прямых препаратах из ворсин хориона или плаценты (99,4 %), мы считаем неоправданным использование КАЖ в качестве единственно возможного образца плодного материала для цитогенетического анализа. Отсутствие в России специальных питательных сред для культивирования клеток хориона (плаценты) является серьезным препятствием для кариотипирования плода по КАЖ в отечественных диагностических центрах.
В настоящее время препараты некультивированных КАЖ используются для получения детальной информации о кариотипе плода методом FISH при верификации гетероплоидии, установленной по клеткам другого происхождения (хорион/плацента, лимфоциты пуповинной крови) (рис. 4.20).
Важное применение КАЖ находят в настоящее время для диагностики наиболее частых хромосомных болезней методом количествен
ной флуоресцентной полимеразной цепной реакции — Quantitative Fluorescent PCR (QF-PCR) (см. главу 9).