Для исследования функционального состояния клеток почечной ткани все чаще используют ферментурию (энзимурию). Первые сообщения о присутствии в моче актизтшх ферментов появились более 100 лет назад, однако интерес к ферментурии возник в последние два-три десятилетия в результате накопления большого клинического и экспериментального материала. В настоящее время в моче обиа ружена активность около 70 ферментов и изоферментов, в основном почечного происхождения. В связи с этим особое внимание стали уделять исследованию ферментов и их изоферментов — весьма чувствительных индикаторов поражения почечной ткани (Фоменко Г.В. и др., 1994),
Действительно, интенсивность выхода в мочу ферментов, вырабатываемых клетками почечного эпителия, можно рассматривать в качестве функциональной характеристики целостности мембранных структур, в первую очередь поверхностной плазматической мембраны.
Диагностическое значение активности ферментов в моче определяют их молекулярная масса, селективность их реабсорбции в проксимальных канальцах и их локализация в структурах нефрона.
В физиологических условиях путем гломерулярной фильтрации из плазмы в мочу экскретируются лишь ферменты с молекулярной массой ниже 70 кД. К ним относятся амилаза, пепсиноген, липаза, лизоцим, рибонуклеаза, трипсиноген, урокиназа и др. (Burchardt U., Scherberich J.E., 1992). Профильтровавшиеся низкомолекулярные ферменты практически полностью реабсорбируются в проксимальных извитых канальцах, поэтому повышенная экскреция этих ферментов с мочой может служить биохимическим маркером поражения тубулярного отдела нефрона (Фоменко Г.В. и др., 1994: Goudswaatrl J., Virela G., 1983; ten Kate R.W. et al., 1989).
При увеличении проницаемости базальной мембраны клубочков становится возможной фильтрация в мочу ферментов с молекулярной массой более 70 тсД, например плазменной холинэстеразы. Этот ферт мент имеет молекулярную массу '140 кД и нс синтезируется клетками почечных канальцев, благодаря чему его можно использовать в качес- I ш- маркера повреждения клубочкового аппарата (Мищенко Б.П. п лр., 1989).
Как известно, почечные канальцы представлены различными гегмептами, отличающимися по протяженности, морфологии клеток, метаболическим и транспортным функциям, а также по участию в регуляция гормонального обмена (Злагопольски Э.К., 1987). Эта функциональная гетерогенность нефрона предопределяет характерную локализацию в его отделах диагностически значимых ферментов.
Основным источником ферментов мочи являются клетки проксимальных канальцев, составляющие около 42% массы почечной ткани. И :шителии этого отдела нефрона локализуется большая группа (более 30) ферментов лизосом и мембран краевой щеточной каемки. Согласно классификации U. Burchardt et al. (1983), в зависимости от внутриклеточной локализации основные диагностически значимые ферменты тубулярного эпителия почек можно разделить на фермеп- | и краевой щелочной каемки, лизосомальные ферменты и ферменты цитозоля.
Ферменты первой группы связаны непосредственно с мембраной щеточной каемки эпителия, причем проч ность этой связи для разных ферментов различна.
Лланинаминопептидаза (ААГ1), участвующая в аминокислотном обмене, располагается в цитоплазматической мембране наиболее поверхностно (Scherbench J.E. et al., 1976). Базальная экскреция с мочой этого фермента наблюдается в физиологических условиях и обусловлена, как считают, простым «смыванием» фермента током канальцевой жидкости. Другой фермент щеточной каемки — гамма-глютамилтранс- фераза (ГГТ), играющая роль в обмене клеточного глютатиона, подобно ААП также располагается на люминальной поверхности клеток тубулярного эпителия и связана с ядром мультиэпзимного комплекса (ScberbenchJ.E. et al., 1978). В результате даже незначительные повреждения щеточной каймы эпителиальных клеток сопровождаются повышением активности обоих ферментов в крови (Любимова Н.В. и лр., 1997; Kocaoglu S. et al., 1997; Fauconneau В. et al,, 1997; Muthukumar A., Selvam R., 1997; DonadioC. et al., 1998). Щелочная фосфатаза (ЩФ) кон тролирует процессы трансмембранного транспорта (Polstra К. et al., 1997). У здоровых людей слабая экскреция этого фермента обусловлена физиологической регенерацией эпителия, при которой возможны разрывы плазматических мембран с освобождением интегрированных в них ферментов.
Щелочная фосфатаза залегает а плазматической мембране глубже, чем другие ферменты щеточной каемки, поэтому экскрети- руется с мочой при более выраженных повреждениях канальцев (Miithiikumar Л., Selvam R., 1997; Massicot F. et al., 1997; Clemo F.A., 1998; Gupta K.L. et al., 1999). Кроме этих энзимов, в мембране щеточной каемки обнаружены нейтральная р-глюкозидаза, трегалаза и сериновая протеаза дипептидил-пептидаза IV (Burchardt U, et al,, 1982) Наибольший интерес для разработки диагностических критериев поражения почек представляет нейтральная а-глюкозида- за, имеющая исключительно почечное происхождение (Лаврено- ваТ.П., 1986, 1990).
Среди лмзосомалиных ферментов клеток канальцевого эпителия, представленных p-глюкуронидазой, кислой фосфатазой, р-галак- тозидазой, лизоцимом и другими ферментами, особого внимания заслуживает И-ацетил-р-В-глюкозаминидаза (Р-гексоаминизада, р- НАГ). Впервые этот фермент был использован в качестве индикатора канальцевых повреждений при исследовании нефротоксического эффекта аминогликозидов, для которых лизосомы эпителия являются своеобразными оргаиеллами-м и тенями (Fauconneau В, et al., 1997).
Благодаря существованию двух изоформ этого фермента удается оценивать морфофункциональные свойства канальцевого эпителия в широком диапазоне. Растворимый изофермент А не связан с лизо- сомальной мембраной и находится внутри этих органелл. У здоровых людей он экскретирустся в мочу путем экзоцитоза (обратного пино- цитоза) как необходимого элемента физиологического обновления мембран (Dupond j.L. etal., 1984). При действии гормонов, субстратов метаболизма, лекарственных препаратов и других ксенобиотиков функциональная нагрузка на клетки может возрастать, что сопровождается экспрессией генов, индукцией лизосомальных ферментов и их усиленным экзоцитозом, однако при этом целостность лизосомальных или цитоплазматических мембран не нарушается (Gibev R. et al., 1986).
Изофсрмент В лизосомальной И-ацетил-р-О-глюкозаминидазы, напротив, является мембраносвязанным белком (Dupond J.L. et al., 1984). В отличие от изофермеша А, его появление в моче в больших количествах свидетельствует о значительных повреждениях канальцев, сопровождающихся деструкцией цитомембран, в том числе лизосомальных.
К цитозольным (цитоплазматическим) ферментам относятся лактатдегидрогеназа (ЛДГ), глютатионИБ-транс фераза, аланинами- потрансфераза (АЛТ), аспартатаминотрапсфераза (ACT), сс-глюко- зидаза и др. (Burchardt U. et al., 1983).
Цитозольные ферменты экскретируются с мочой даже при незна- ч отельных структурных повреждениях мембран. В качестве индикатора нарушений мембранной проницаемости канальцевого эпителия для оценки жизнеспособности клеток обычно используют ЛДГ (Пугачева В.14., 1972, Zuo D.M., 1997; Portilla D., 1997; Kabore A.F. ct al, 1997; Obatomi D.K. ct al., 1998; Edelstein C.L. et al., 1999; Williams I.M. rt al., 1999; Yn P.H., Chatterjee P.K. et. al, 2000; Eashola T.O. ct al., 2000), трансаминазы ACT и АЛТ (Kossmann S. et al., 1997; Jan C.R. et al.,
1998).
Наряду с другими цитоплазматическими ферментами, глютатион- S-трансферазу относят к маркерам тубулярного некроза. Определение активности этого фермента в моче представляет собой один из важных гостов в токсикологических исследованиях (Dierick P.J., Noble Е., 1997; .Sl.ajn A. et al. 1997; Kharasch E.D. et al., 1997; Branten A.J. ei a!., 2000).
Таким образом, спектр и активность экскретируемых с мочой ферментов при физиологических условиях и различных патологических состояниях, сопровождающихся повреждением почек, заметно различаются. Обобщенно это представлено в табл. 4.8.
Следовательно, различная внутриклеточная локализация ферментов канальцевого эпителия предопределяет возможность клинического использования ферментов мочи для оценки тубулярных поражений при уронефрологических заболеваниях.
В диагностике заболеваний почек, кроме клинических аспектов, большое значение имеет оценка структурно-функционально \ целостности этого органа. Этой цели служат различные виды инструментальных исследований, в основном инвазивных и не всегда пригодных для активного мониторинга урологических заболеваний. В этом плане большого внимания заслуживает определение активности почечных ферментов в моче.
В последние годы накапливается большой фактический материал о клиническом применении ферментурии. Острая почечная недостаточность различного генеза сопровождается повышением экскреции с мочой ферментов щеточной каемки: нейтральной эндо- пептидазы (Nambi Р. et al., 1999), ААП (Burchardt. U. et al., 1975). ЩФ и ITT (Khundmiri SJ. et al., 1997), а также лизосомальных ферментов • (Ml АГ (Lochhead K.M. ct a!., 1997), [3-глгакуропидазы и лизоци-
ма (Piurchardt U. et al., 1975). Гемодиализ ведет к резкому снижению . ипшмурии (Burchardt U. et al., 1975).
При гломерулярных заболеваниях и патологии извитых канальцев почек наибольшее значение имеет лейцинаминопептидаза (ЛАП), i;ik как ее содержание в клубочках и указанных отделах канальцев и.юбилее высоко (Шепотиновский В.П. идр., 1980), при пиелонефрите — лактатдегидрогенааа (ЛДГ), глутаминаза, аспарагин аза (11угачева В.И., 1972; Матвеев М.П. и др., 1980), сукциндегидрогеназа ((:/уГ), кислая фосфатаза (Ситникова В.П. и др., 1980; Лысоченко В. Л. н др., 1980).
Кислые гидролазы ((3-глюкуронидаза, М-ацетпл-р-О-глюкурони- лаза), кислая фосфатаза (КФ) используют для диагностики волчаночного нефрита (Приваленко М.Н. идр., 1974; Каинова А.С. идр., I977), При гломерулонефрите повышается активность МДГ, Г-6- lt;ГV1П» Р-глюкуронидазы, лизоцима (Волкова Л.Д., 1974; Керимов Н.Б., Густамов Я.К., 1975).
Наиболее широко в клинике применяют биохимические методы исследования ферментов в биологических жидкостях организма,
пк как гистохимическое изучение ферментов пока ограничено. При почечных заболеваниях изучение ферментов в моче имеет большее дпагностическое значение, чем их определение в сыворотке крови.
Особенно важно определение ферментов при динамическом наблюдении за больным, так как оно позволяет раньше, чем обычные лабораторные методы, выявить характер заболевания (Пугачева В.И., Юрков Ю.А., 1970; Шеметов В.Д., 1973; Клемина И.К., Дэви Э.Б., 1976; М лтвеев М.П. идр., 1980; МошкинаА.В. идр., 1980).
В медицинской литературе широко обсуждается вопрос, об источ- нике ферментурии (Габуния Д.Д. идр., 1979). Однако, как показали работы В.И. Пугачевой и Ю.А. Юркова (1972), в период клиниколабораторной ремиссии при отсутствии в моче ферментных элементов крови и микроорганизмов активность ферментов (ЛДГ) остается значительной, что указывает на поражение ткани почек.
Новые возможности для использования показателей ферментативных процессов в качестве органоспецифических тестов возникли благодаря открытию изоферментов. Основанием для этого явилось установленное при изучении ЛДГ положение, что каждой ткани и органу животного организма соответствует постоянный спектр изоферментов.
Множество ферментов существует в многомолекулярной форме, Но в клинической практике изучены только единичные. Отчетливое
различие в распределен tin изо ферментов в разных слоях почечной паренхимы послужи ли предпосылкой л ля использования этого теста в диагностике ряда почечных заболеваний. Большое диагностическое значение придают изучению изоферментного спектра лактатде- гидрогеназы (ЛДГ). малатдегидрогеназы (МДГ), альдолазы (АЛД).
Ферментную активность определяют в утренней порции мочи, которую подвергают диализу для удаления ингибиторов. В норме общая активность ЛДГ в моче здоровых детей проявляется анодными фракциями ЛДГ-1 и ЛДГ-2 с преобладанием ЛДГ-2 (табл. 4.9).
Таблица 4 9
Показатели активности ЛДГ в моче здоровых детей (Пугачева В.И., 1969)
При обострении любой формы пиелонефрита в моче у большинства детей появляются катодные фракции (от 3 до 5 фракций), при этом определяется зависимость спектра от формы пиелонефрита, длительности заболевания и распространенности процесса в почках. Так, у детей с выраженной клинической картиной кеобструктивного пиелонефрита при давности заболевания до 3-х лет отмечается увеличение активности катодных фракций, причем бопее значительное при двустороннем процессе. Самые резкие изменения обнаруживаются у больных с обструктивными формами пиелонефрита: у всех детей в моче определяется 5 фракций, причем преобладает активность катодных фракций (рис. 4.1). Преимущественное содержание анодных фракций (ЛДГ-1 и ЛДГ-2) при наличии всех 5 фракций и незначительная активность бывают при наименьшем поражении почек (Пугачева В.И., 1972).
Общая активность ЛДГ в моче больных пиелонефритом в среднем достигает 37,5±3,5 единицы Вроблевского, но какой-либо ее зависимости от формы и тяжести пиелонефрита не отмечено.
Перспективными для изучения при воспалительных заболеваниях почек являются ферменты малатдегидрогеназа (МДГ) и аль-
Рис. 4.1. Спектр изоферментов ЛДГ в моче.
;i в норме; б - при первичном пиелонефрите; в — при обструктивном вторичном пиелонефрите.
дол аз а (АЛД). МДГ относится к ферментам цикла Кребса, который катализирует обратимую реакцию окисления яблочной кислоты в щлпелевоуксусную при участии кофермента НАД. МДГ находится но всех тканях организма, в том числе и почечной, в митохондриальной (М-МДГ) и цитоплазматической (Ц-МДГ) клеточной форме. Считают, что катодные фракции МДГ по происхождению являются митохондриальными, а анодные — цитоплазматическими. У здоровых детей обе фракции обнаруживаются в следовых количествах с преобладанием катодной (М-МДГ), реже определяется одна фракция (катодная). Общая активность МДГ в 1 мл мочи составляет 1 ,43±0,Г1 единицы Врублевского, в суточной моче 695,22x0,86 единицы. [ 1ри воспалительных заболеваниях почек (пиелонефрите) в спектре МДГ мочи в большинстве случаев содержится от 2 до 4 фракций (2 анодные и 2 катодные). Абсолютная величина катодных фракций МДГ при обструктивном пиелонефрите в 25 раз превышает те же показатели у здоровых детей и в 8 раз — у больных необструктивным пиелонефритом. Общая активность МДГ в моче по сравнению со здоровыми детьми в 20 раз выше (Волкова Л.Д., 1975).
При пиелонефрите представляет интерес исследование АЛД — фермента, катализирующего расщепление 1,6-дифосфорного эфира фруктозы на фосфотриозу. Изоферменты АЛД в моче здоровых детей включают в себя анодную— АЛД-1 (М~1,43+0,24) и катодную— АЛД-3 (М=1,42±0,24) фракции. У многих здоровых детей фрикции АЛД полностью отсутствовали. У больных острым пиелонефритом в активной фазе общая активность АЛД повышается в 2 раза по сравнению со здоровыми детьми. Спектр изоферментов АЛД характеризуется увеличением активности АЛД-1 и, кроме того, АЛД-2, отсутствующей у здоровых детей (Николаева Э.В., 1973). При хроническом пиелонефрите обнаруживается АЛД-4, которой нет при остром пиелонефрите.
При хронической почечной недостаточности общая активность ЛДГ и МД Г снижается. Менее активны также катодные фракции. У некоторых детей спектр изиферментов не отличается от такового у здорового ребенка Это можно объяснить общим уменьшением числа действующих нефронов, в которых резко нарушается канальцевая функция; инактивацией ферментов на почве полиурии вследствие резкого расстройства выделительной функции почек; угнетением синтеза катодных фракций вследствие резких рарушений обменных процессов в патологически измененных почках.
В последние годы решены многие методические вопросы, уточнены представления об источниках ферментурии, что позволяет более широко рекомендовать определение активности ферментов в моче в нефрологической практике.
Уровень ферментативной активности мочи, особенно органоспецифических ферментов, при заболеваниях почек является довольно ранним, динамичным диагностическим тестом для оценки степени повреждения почечной ткани, активности заболевания и его прогноза.
Для энзимодиагностики нефропатии определен комплекс наиболее информативных ферментов. Эти ферменты содержатся преимущественно в энителиоцитах проксимального отдела нефрона и, что особенно важно, имеют различную внутриклеточную локализацию. Аланинаминоиептидаза (ААП), щелочная фосфатаза (ШФ) и гамма-глютамилтрансфераза (ГГТ) связаны с цитоплазматическом мембраной тубулярного эпителия. Лантатдегидрогеназа (ЛДГ) — цитоплазматический фермент, р-галактозидаза (ГАЛ), N-ацетил- P-D-глюкозаминидаза (НАГ) — лизосомальные ферменты; мал а т дегидрогеназа (МДГ) — преимущественно митохондриальный энзим.
Наличие этих ферментон позволяет характеризовать глубину и выраженность повреждения пефротелия. Кроме того, раздельное определение Н- и М-субъединиц (анодных и катодных изоферментов) ЛДГ с учетом различия активности этих кзоферментов ЛДГ в корковом и мозговом слоях почки позволяет выявлять уровень преимущественного поражения почечной ткани (Фокеева В.В. и др., 1989), Для оценки состоянья клубочкового фильтра в моче опреде- ||яки активность холинэстеразы (ХЭ) — фермента, отсутствующего и почечной ткани, но присутствующего в крови.
Грецкие значения активности ферментов в моче у здоровых детей представлены в табл. 4.10. Зависимости экскреции ферментов с мочой от возраста и пола не выявлены.
Таблица 4.10
Активность ферментов в моче (М+ш) у 50 практически здоровых детей
Г учетом активности ХЭ в моче выделяют 3 степени нарушения проницаемости гломерулярного фильтра у детей (Фокеева В.В, и др., 1089):
Комплексная патогенетическая оценка функционального состоянии псфрона у детей (Фокеева В.В. и др., 19S9) проводится на основании следующих энзимоморфологических синдромов:
Для характеристики выраженности патологического сдвига каждого из тестов учитывается степень его изменения по сравнению с контрольной группой. Целесообразно выделить 3 степени патологического сдвига:
Для оценки степени нарушения проницаемости гломерулярного фильтра по ХЭ используется описанная выше классификация.
На каждого больного с почечной патологией на основании анализа ферментурии с учетом степени патологического сдвига каждого из тестов и примененного патофизиологического принципа создается индивидуальная энзимоурограмма, которая косвенно позволяет судить о структурных изменениях различных отделов нефрона.
Действительно, интенсивность выхода в мочу ферментов, вырабатываемых клетками почечного эпителия, можно рассматривать в качестве функциональной характеристики целостности мембранных структур, в первую очередь поверхностной плазматической мембраны.
Диагностическое значение активности ферментов в моче определяют их молекулярная масса, селективность их реабсорбции в проксимальных канальцах и их локализация в структурах нефрона.
В физиологических условиях путем гломерулярной фильтрации из плазмы в мочу экскретируются лишь ферменты с молекулярной массой ниже 70 кД. К ним относятся амилаза, пепсиноген, липаза, лизоцим, рибонуклеаза, трипсиноген, урокиназа и др. (Burchardt U., Scherberich J.E., 1992). Профильтровавшиеся низкомолекулярные ферменты практически полностью реабсорбируются в проксимальных извитых канальцах, поэтому повышенная экскреция этих ферментов с мочой может служить биохимическим маркером поражения тубулярного отдела нефрона (Фоменко Г.В. и др., 1994: Goudswaatrl J., Virela G., 1983; ten Kate R.W. et al., 1989).
При увеличении проницаемости базальной мембраны клубочков становится возможной фильтрация в мочу ферментов с молекулярной массой более 70 тсД, например плазменной холинэстеразы. Этот ферт мент имеет молекулярную массу '140 кД и нс синтезируется клетками почечных канальцев, благодаря чему его можно использовать в качес- I ш- маркера повреждения клубочкового аппарата (Мищенко Б.П. п лр., 1989).
Как известно, почечные канальцы представлены различными гегмептами, отличающимися по протяженности, морфологии клеток, метаболическим и транспортным функциям, а также по участию в регуляция гормонального обмена (Злагопольски Э.К., 1987). Эта функциональная гетерогенность нефрона предопределяет характерную локализацию в его отделах диагностически значимых ферментов.
Основным источником ферментов мочи являются клетки проксимальных канальцев, составляющие около 42% массы почечной ткани. И :шителии этого отдела нефрона локализуется большая группа (более 30) ферментов лизосом и мембран краевой щеточной каемки. Согласно классификации U. Burchardt et al. (1983), в зависимости от внутриклеточной локализации основные диагностически значимые ферменты тубулярного эпителия почек можно разделить на фермеп- | и краевой щелочной каемки, лизосомальные ферменты и ферменты цитозоля.
Ферменты первой группы связаны непосредственно с мембраной щеточной каемки эпителия, причем проч ность этой связи для разных ферментов различна.
Лланинаминопептидаза (ААГ1), участвующая в аминокислотном обмене, располагается в цитоплазматической мембране наиболее поверхностно (Scherbench J.E. et al., 1976). Базальная экскреция с мочой этого фермента наблюдается в физиологических условиях и обусловлена, как считают, простым «смыванием» фермента током канальцевой жидкости. Другой фермент щеточной каемки — гамма-глютамилтранс- фераза (ГГТ), играющая роль в обмене клеточного глютатиона, подобно ААП также располагается на люминальной поверхности клеток тубулярного эпителия и связана с ядром мультиэпзимного комплекса (ScberbenchJ.E. et al., 1978). В результате даже незначительные повреждения щеточной каймы эпителиальных клеток сопровождаются повышением активности обоих ферментов в крови (Любимова Н.В. и лр., 1997; Kocaoglu S. et al., 1997; Fauconneau В. et al,, 1997; Muthukumar A., Selvam R., 1997; DonadioC. et al., 1998). Щелочная фосфатаза (ЩФ) кон тролирует процессы трансмембранного транспорта (Polstra К. et al., 1997). У здоровых людей слабая экскреция этого фермента обусловлена физиологической регенерацией эпителия, при которой возможны разрывы плазматических мембран с освобождением интегрированных в них ферментов.
Щелочная фосфатаза залегает а плазматической мембране глубже, чем другие ферменты щеточной каемки, поэтому экскрети- руется с мочой при более выраженных повреждениях канальцев (Miithiikumar Л., Selvam R., 1997; Massicot F. et al., 1997; Clemo F.A., 1998; Gupta K.L. et al., 1999). Кроме этих энзимов, в мембране щеточной каемки обнаружены нейтральная р-глюкозидаза, трегалаза и сериновая протеаза дипептидил-пептидаза IV (Burchardt U, et al,, 1982) Наибольший интерес для разработки диагностических критериев поражения почек представляет нейтральная а-глюкозида- за, имеющая исключительно почечное происхождение (Лаврено- ваТ.П., 1986, 1990).
Среди лмзосомалиных ферментов клеток канальцевого эпителия, представленных p-глюкуронидазой, кислой фосфатазой, р-галак- тозидазой, лизоцимом и другими ферментами, особого внимания заслуживает И-ацетил-р-В-глюкозаминидаза (Р-гексоаминизада, р- НАГ). Впервые этот фермент был использован в качестве индикатора канальцевых повреждений при исследовании нефротоксического эффекта аминогликозидов, для которых лизосомы эпителия являются своеобразными оргаиеллами-м и тенями (Fauconneau В, et al., 1997).
Благодаря существованию двух изоформ этого фермента удается оценивать морфофункциональные свойства канальцевого эпителия в широком диапазоне. Растворимый изофермент А не связан с лизо- сомальной мембраной и находится внутри этих органелл. У здоровых людей он экскретирустся в мочу путем экзоцитоза (обратного пино- цитоза) как необходимого элемента физиологического обновления мембран (Dupond j.L. etal., 1984). При действии гормонов, субстратов метаболизма, лекарственных препаратов и других ксенобиотиков функциональная нагрузка на клетки может возрастать, что сопровождается экспрессией генов, индукцией лизосомальных ферментов и их усиленным экзоцитозом, однако при этом целостность лизосомальных или цитоплазматических мембран не нарушается (Gibev R. et al., 1986).
Изофсрмент В лизосомальной И-ацетил-р-О-глюкозаминидазы, напротив, является мембраносвязанным белком (Dupond J.L. et al., 1984). В отличие от изофермеша А, его появление в моче в больших количествах свидетельствует о значительных повреждениях канальцев, сопровождающихся деструкцией цитомембран, в том числе лизосомальных.
К цитозольным (цитоплазматическим) ферментам относятся лактатдегидрогеназа (ЛДГ), глютатионИБ-транс фераза, аланинами- потрансфераза (АЛТ), аспартатаминотрапсфераза (ACT), сс-глюко- зидаза и др. (Burchardt U. et al., 1983).
Цитозольные ферменты экскретируются с мочой даже при незна- ч отельных структурных повреждениях мембран. В качестве индикатора нарушений мембранной проницаемости канальцевого эпителия для оценки жизнеспособности клеток обычно используют ЛДГ (Пугачева В.14., 1972, Zuo D.M., 1997; Portilla D., 1997; Kabore A.F. ct al, 1997; Obatomi D.K. ct al., 1998; Edelstein C.L. et al., 1999; Williams I.M. rt al., 1999; Yn P.H., Chatterjee P.K. et. al, 2000; Eashola T.O. ct al., 2000), трансаминазы ACT и АЛТ (Kossmann S. et al., 1997; Jan C.R. et al.,
1998).
Наряду с другими цитоплазматическими ферментами, глютатион- S-трансферазу относят к маркерам тубулярного некроза. Определение активности этого фермента в моче представляет собой один из важных гостов в токсикологических исследованиях (Dierick P.J., Noble Е., 1997; .Sl.ajn A. et al. 1997; Kharasch E.D. et al., 1997; Branten A.J. ei a!., 2000).
Таким образом, спектр и активность экскретируемых с мочой ферментов при физиологических условиях и различных патологических состояниях, сопровождающихся повреждением почек, заметно различаются. Обобщенно это представлено в табл. 4.8.
Следовательно, различная внутриклеточная локализация ферментов канальцевого эпителия предопределяет возможность клинического использования ферментов мочи для оценки тубулярных поражений при уронефрологических заболеваниях.
В диагностике заболеваний почек, кроме клинических аспектов, большое значение имеет оценка структурно-функционально \ целостности этого органа. Этой цели служат различные виды инструментальных исследований, в основном инвазивных и не всегда пригодных для активного мониторинга урологических заболеваний. В этом плане большого внимания заслуживает определение активности почечных ферментов в моче.
В последние годы накапливается большой фактический материал о клиническом применении ферментурии. Острая почечная недостаточность различного генеза сопровождается повышением экскреции с мочой ферментов щеточной каемки: нейтральной эндо- пептидазы (Nambi Р. et al., 1999), ААП (Burchardt. U. et al., 1975). ЩФ и ITT (Khundmiri SJ. et al., 1997), а также лизосомальных ферментов • (Ml АГ (Lochhead K.M. ct a!., 1997), [3-глгакуропидазы и лизоци-
ма (Piurchardt U. et al., 1975). Гемодиализ ведет к резкому снижению . ипшмурии (Burchardt U. et al., 1975).
При гломерулярных заболеваниях и патологии извитых канальцев почек наибольшее значение имеет лейцинаминопептидаза (ЛАП), i;ik как ее содержание в клубочках и указанных отделах канальцев и.юбилее высоко (Шепотиновский В.П. идр., 1980), при пиелонефрите — лактатдегидрогенааа (ЛДГ), глутаминаза, аспарагин аза (11угачева В.И., 1972; Матвеев М.П. и др., 1980), сукциндегидрогеназа ((:/уГ), кислая фосфатаза (Ситникова В.П. и др., 1980; Лысоченко В. Л. н др., 1980).
Кислые гидролазы ((3-глюкуронидаза, М-ацетпл-р-О-глюкурони- лаза), кислая фосфатаза (КФ) используют для диагностики волчаночного нефрита (Приваленко М.Н. идр., 1974; Каинова А.С. идр., I977), При гломерулонефрите повышается активность МДГ, Г-6- lt;ГV1П» Р-глюкуронидазы, лизоцима (Волкова Л.Д., 1974; Керимов Н.Б., Густамов Я.К., 1975).
Наиболее широко в клинике применяют биохимические методы исследования ферментов в биологических жидкостях организма,
пк как гистохимическое изучение ферментов пока ограничено. При почечных заболеваниях изучение ферментов в моче имеет большее дпагностическое значение, чем их определение в сыворотке крови.
Особенно важно определение ферментов при динамическом наблюдении за больным, так как оно позволяет раньше, чем обычные лабораторные методы, выявить характер заболевания (Пугачева В.И., Юрков Ю.А., 1970; Шеметов В.Д., 1973; Клемина И.К., Дэви Э.Б., 1976; М лтвеев М.П. идр., 1980; МошкинаА.В. идр., 1980).
В медицинской литературе широко обсуждается вопрос, об источ- нике ферментурии (Габуния Д.Д. идр., 1979). Однако, как показали работы В.И. Пугачевой и Ю.А. Юркова (1972), в период клиниколабораторной ремиссии при отсутствии в моче ферментных элементов крови и микроорганизмов активность ферментов (ЛДГ) остается значительной, что указывает на поражение ткани почек.
Новые возможности для использования показателей ферментативных процессов в качестве органоспецифических тестов возникли благодаря открытию изоферментов. Основанием для этого явилось установленное при изучении ЛДГ положение, что каждой ткани и органу животного организма соответствует постоянный спектр изоферментов.
Множество ферментов существует в многомолекулярной форме, Но в клинической практике изучены только единичные. Отчетливое
различие в распределен tin изо ферментов в разных слоях почечной паренхимы послужи ли предпосылкой л ля использования этого теста в диагностике ряда почечных заболеваний. Большое диагностическое значение придают изучению изоферментного спектра лактатде- гидрогеназы (ЛДГ). малатдегидрогеназы (МДГ), альдолазы (АЛД).
Ферментную активность определяют в утренней порции мочи, которую подвергают диализу для удаления ингибиторов. В норме общая активность ЛДГ в моче здоровых детей проявляется анодными фракциями ЛДГ-1 и ЛДГ-2 с преобладанием ЛДГ-2 (табл. 4.9).
Таблица 4 9
Показатели активности ЛДГ в моче здоровых детей (Пугачева В.И., 1969)
|
Показатель |
Пределы колебаний, % |
М±ш |
|
ЛДГ-1 |
*32-100 |
73,4±4,7 |
|
ЛДГ-2 |
2-53,5 |
23,9±2,5 |
|
лдг-з |
0-15,3 |
2,5+1,4 |
|
Общая активность в единицах Вроблевского |
1,63-28,3 |
9,76±0,72 |
При обострении любой формы пиелонефрита в моче у большинства детей появляются катодные фракции (от 3 до 5 фракций), при этом определяется зависимость спектра от формы пиелонефрита, длительности заболевания и распространенности процесса в почках. Так, у детей с выраженной клинической картиной кеобструктивного пиелонефрита при давности заболевания до 3-х лет отмечается увеличение активности катодных фракций, причем бопее значительное при двустороннем процессе. Самые резкие изменения обнаруживаются у больных с обструктивными формами пиелонефрита: у всех детей в моче определяется 5 фракций, причем преобладает активность катодных фракций (рис. 4.1). Преимущественное содержание анодных фракций (ЛДГ-1 и ЛДГ-2) при наличии всех 5 фракций и незначительная активность бывают при наименьшем поражении почек (Пугачева В.И., 1972).
Общая активность ЛДГ в моче больных пиелонефритом в среднем достигает 37,5±3,5 единицы Вроблевского, но какой-либо ее зависимости от формы и тяжести пиелонефрита не отмечено.
Перспективными для изучения при воспалительных заболеваниях почек являются ферменты малатдегидрогеназа (МДГ) и аль-
Рис. 4.1. Спектр изоферментов ЛДГ в моче.
;i в норме; б - при первичном пиелонефрите; в — при обструктивном вторичном пиелонефрите.
дол аз а (АЛД). МДГ относится к ферментам цикла Кребса, который катализирует обратимую реакцию окисления яблочной кислоты в щлпелевоуксусную при участии кофермента НАД. МДГ находится но всех тканях организма, в том числе и почечной, в митохондриальной (М-МДГ) и цитоплазматической (Ц-МДГ) клеточной форме. Считают, что катодные фракции МДГ по происхождению являются митохондриальными, а анодные — цитоплазматическими. У здоровых детей обе фракции обнаруживаются в следовых количествах с преобладанием катодной (М-МДГ), реже определяется одна фракция (катодная). Общая активность МДГ в 1 мл мочи составляет 1 ,43±0,Г1 единицы Врублевского, в суточной моче 695,22x0,86 единицы. [ 1ри воспалительных заболеваниях почек (пиелонефрите) в спектре МДГ мочи в большинстве случаев содержится от 2 до 4 фракций (2 анодные и 2 катодные). Абсолютная величина катодных фракций МДГ при обструктивном пиелонефрите в 25 раз превышает те же показатели у здоровых детей и в 8 раз — у больных необструктивным пиелонефритом. Общая активность МДГ в моче по сравнению со здоровыми детьми в 20 раз выше (Волкова Л.Д., 1975).
При пиелонефрите представляет интерес исследование АЛД — фермента, катализирующего расщепление 1,6-дифосфорного эфира фруктозы на фосфотриозу. Изоферменты АЛД в моче здоровых детей включают в себя анодную— АЛД-1 (М~1,43+0,24) и катодную— АЛД-3 (М=1,42±0,24) фракции. У многих здоровых детей фрикции АЛД полностью отсутствовали. У больных острым пиелонефритом в активной фазе общая активность АЛД повышается в 2 раза по сравнению со здоровыми детьми. Спектр изоферментов АЛД характеризуется увеличением активности АЛД-1 и, кроме того, АЛД-2, отсутствующей у здоровых детей (Николаева Э.В., 1973). При хроническом пиелонефрите обнаруживается АЛД-4, которой нет при остром пиелонефрите.
При хронической почечной недостаточности общая активность ЛДГ и МД Г снижается. Менее активны также катодные фракции. У некоторых детей спектр изиферментов не отличается от такового у здорового ребенка Это можно объяснить общим уменьшением числа действующих нефронов, в которых резко нарушается канальцевая функция; инактивацией ферментов на почве полиурии вследствие резкого расстройства выделительной функции почек; угнетением синтеза катодных фракций вследствие резких рарушений обменных процессов в патологически измененных почках.
В последние годы решены многие методические вопросы, уточнены представления об источниках ферментурии, что позволяет более широко рекомендовать определение активности ферментов в моче в нефрологической практике.
Уровень ферментативной активности мочи, особенно органоспецифических ферментов, при заболеваниях почек является довольно ранним, динамичным диагностическим тестом для оценки степени повреждения почечной ткани, активности заболевания и его прогноза.
Для энзимодиагностики нефропатии определен комплекс наиболее информативных ферментов. Эти ферменты содержатся преимущественно в энителиоцитах проксимального отдела нефрона и, что особенно важно, имеют различную внутриклеточную локализацию. Аланинаминоиептидаза (ААП), щелочная фосфатаза (ШФ) и гамма-глютамилтрансфераза (ГГТ) связаны с цитоплазматическом мембраной тубулярного эпителия. Лантатдегидрогеназа (ЛДГ) — цитоплазматический фермент, р-галактозидаза (ГАЛ), N-ацетил- P-D-глюкозаминидаза (НАГ) — лизосомальные ферменты; мал а т дегидрогеназа (МДГ) — преимущественно митохондриальный энзим.
Наличие этих ферментон позволяет характеризовать глубину и выраженность повреждения пефротелия. Кроме того, раздельное определение Н- и М-субъединиц (анодных и катодных изоферментов) ЛДГ с учетом различия активности этих кзоферментов ЛДГ в корковом и мозговом слоях почки позволяет выявлять уровень преимущественного поражения почечной ткани (Фокеева В.В. и др., 1989), Для оценки состоянья клубочкового фильтра в моче опреде- ||яки активность холинэстеразы (ХЭ) — фермента, отсутствующего и почечной ткани, но присутствующего в крови.
Грецкие значения активности ферментов в моче у здоровых детей представлены в табл. 4.10. Зависимости экскреции ферментов с мочой от возраста и пола не выявлены.
| Исследуемые
ферменты |
Активность (нмоль/с мМ кр.) | Исследуемые
ферменты |
Активность (пмоль/с мМ кр.) |
| ЛАПП | 15,5±2,8 | мдг | 53,8±9,5 |
| ЩФ | 21,7±1,3 | гтг | 32,7+ 3.0 |
| ЛДГ | 37,4+3,3 | НАГ | 1,810,43 |
| ЛДГ-Н | 18,4±2,5 | ГАЛ | 6,2±0,84 |
| лдг-м | 19,0+4,3 | ХЭ | 11,7±3,3 |
Таблица 4.10
Активность ферментов в моче (М+ш) у 50 практически здоровых детей
Г учетом активности ХЭ в моче выделяют 3 степени нарушения проницаемости гломерулярного фильтра у детей (Фокеева В.В, и др., 1089):
- I степень — активность ХЭ в моче от 35,0 до 167,0 кмоль/с мМ кр; характерна для нейропатий, протекающих с гематурией, и для нефротической формы гломерулонефрита;
- II степень — активность X, в моче от 167,1 до 334,0 кмоль/с мМ кр; типична для смешанной формы гломерулонефрита при активности процесса П-Ш степени;
- III степень — активность X, в моче более 334,1 нмоль/с мМ кр; встречается при тяжелых формах гломерулонефрита с выраженным нефротическим синдромом, часто резистентных к терапии и нередко с неблагоприятным прогнозом (табл. 4.11).
Комплексная патогенетическая оценка функционального состоянии псфрона у детей (Фокеева В.В. и др., 19S9) проводится на основании следующих энзимоморфологических синдромов:
- ( индром повышенной гломерулярной проницаемости с повышением активности в моче ХЭ и/или уровня альбумина;
- синдром повышенной проницаемости цитомембран цефротелия; проявляется повышением активности в моче цитоплазматических ферментив, в первую очередь ЛДГ;
- синдром повреждения щеточной каемки тубулярного эпителия с увеличением активности в моче мембранных ферментов; чаще встречается в сочетании с остальными синдромами;
- синдром цитолиза нафротелия, означающий различную степень повреждения клетки до се полного некроза, с повышением активности в моче лизосомальных и митохондриальных энзимов; наиболее выражен при смешанной форме гломерулонефрита;
- синдром ферментативной недостаточности нсфротелия; проявляется нормальной или низкой ферментурией, в первую очередь мембранных ферментов; чаще выявляется у больных с дизмета- болической нефропатией и нефропатией, связанной с гипоплас- тической дисплазией.
Для характеристики выраженности патологического сдвига каждого из тестов учитывается степень его изменения по сравнению с контрольной группой. Целесообразно выделить 3 степени патологического сдвига:
- I степень — показатели изменяются по сравнению с нормой (повышаются или понижаются) на 2,5-3,0 ст;
- II степень — 3,1-4,0 ст;
- Ш степень — более чем на 4,0 а.
Для оценки степени нарушения проницаемости гломерулярного фильтра по ХЭ используется описанная выше классификация.
На каждого больного с почечной патологией на основании анализа ферментурии с учетом степени патологического сдвига каждого из тестов и примененного патофизиологического принципа создается индивидуальная энзимоурограмма, которая косвенно позволяет судить о структурных изменениях различных отделов нефрона.