Идеи и методы, разработанные генетикой микроорганизмов, молекулярной генетикой и биохимией нуклеиновых кислот, составили научную основу для развития генетической инженерии - науки о конструировании организмов с заданными наследственными свойствами. Начало развития генетической инженерии относится к 1972 г. и связано с работами П. Берга и его сотрудников (США), сконструированных in vitro (вне организма) первую рекомбинантную (гибридную) молекулу ДНК. В состав молекулы входили гены разного происхождения: полный геном онкогенного вируса обезьян SV40, часть генома умеренного фага и гены галактозного оперона Е. coli. Хотя эта молекула не была исследована на функциональную активность из-за опасения перенести онкогенные вирусы в организм человека, успешные эксперименты по ее созданию послужили основанием для активизации работ в области генетической инженерии.
Сущность генетической инженерии заключается в направленном конструировании рекомбинантных молекул ДНК in vitro с последующим введением их в живой организм. При этом, искусственно созданная молекула ДНК становится составной частью генетического аппарата реципиентного организма и придает ему новые генетические свойства. Рекомбинантные молекулы ДНК с заданными свойствами получают путем объединения двух или более фрагментов ДНК (генов) разного происхождения, затем с помощью специальных переносчиков, так называемых векторов, вводят их в реципиентную клетку. Таким путем гены из одного генетического
окружения перемещаются в другое. Это приводит к различным фенотипическим изменениям клетки.
В генетической инженерии выделяют две области - генную и геномную. Каждая из них преследует разные цели: генная - получение организмов с новыми, несвойственными данному виду признаками. Видовая принадлежность организма при этом не меняется.
Геномная инженерия предусматривает более глубокое вмешательство в геном вплоть до создания организмов нового вида.
Успешное проведение экспериментов по конструированию искусственных генетических структур - рекомбинантных ДНК - стало возможным после того, как в распоряжении исследователей оказались соответствующие ферменты - рестрикционные эндонуклеазы, расщепляющие молекулы ДНК в строго определенных участках, и лигазы, сшивающие фрагменты ДНК в единую молекулу.
Конструирование штаммов микроорганизмов с новыми свойствами метода генетической инженерии включает ряд этапов: получение отдельных генов (фрагментов ДНК), присоединение генов к векторным молекулам, т. е. получение рекомбинантной молекулы ДНК, введение рекомбинантной ДНК в реципиентную клетку.
Для создания рекомбинантных молекул ДНК могут быть использованы гены природной ДНК, выделенной из разных организмов, или гены, полученные путем химического или ферментативного синтеза. Выделение нужных генов из ДНК осуществляют с помощью ферментов рестрикции (расщепления) - рестриктаз, или рестриктирующих эндонуклеаз. Они узнают в двухцепочечной ДНК специфические последовательности (мишени), связываются с ними и расщепляют ДНК в самом месте-мишени. Рестриктазы, расщепляющие ДНК в строго определенных сайтах, отнесены ко второму классу (тип Hind П). Они в основном и применяются в генной инженерии. Рестриктазы способны распозновать в ДНК последовательность из 4-6 п. н. и разрезать ее либо пополам, либо на неравные части с образованием выступающих одноцепочечных концов. Одна и та же рестриктаза разрезает разные ДНК с образованием концов с одинаковой последовательностью нуклеотидов. Эти
концы получили название «липких». В силу одинаковой нуклеотидной последовательности они комплементарны друг другу и могут гибридизоваться между собой. Это позволяет объединять фрагменты ДНК различного происхождения, а также включать гены в состав вектора.
Химический синтез генов образуется на сведениях о первичной структуре кодируемых ими белков (последовательности аминокислот в молекуле белка). Впервые химический синтез гена был осуществлен в 1969 г. Г. Кораной с сотрудниками. Это был ген аланиновой тРНК дрожжей, содержащий 77 п.н. Но он не обладал функциональной активностью. Позднее ими был синтезирован функционально активный ген тирозиновой тРНК Е. coli длиной около 200 п. н.
В настоящее время химически синтезированные гены используются для получения многих пептидных гормонов, в их числе гормона роста человека - соматотропина. Ген, кодирующий этот гормон, имеет длину 584 п. н. Он включен в плазмиду и введен в Е. coli, где реплицируется в составе плазмиды под контролем промотора триптофанового оперона. Методом химического синтеза получен также ген инсулина человека. Искусственное получение генов осуществляется также путем ферментативного синтеза при участии РНК-зависимой ДНК-полимеразы или обратной транскриптазы. В присутствии соответствующих иРНК этот фермент может катализировать синтез любого гена. Таким способом был синтезирован ген интерферона человека. Для его введения в клетки бактерий сконструирована рекомбинантная плазмида, включающая ген интерферона и сигнальные последовательности, инициирующие синтез иРНК и белка, так называемая химерная плазмида (не встречающаяся в природе). Плазмида введена в Е. coli. Полученный штамм бактерий синтезирует до 5 мг интерферона на 1 л бактериальной суспензии, что в 5 000 раз превышает его содержание в 1 л донорской крови.
Гены, полученные любым способом, вводятся в реципиентную клетку с помощью векторов, так как они не имеют системы сигналов, управляющей их действием в клетке, и не способны к самостоятельной репликации. Вектор - это молекула ДНК, способная переносить в клетку чужеродную ДНК и обеспечивать там ее
размножение и наследование. Вектор должен обладать свойством автономной репликации, т. е. быть репликоном, нести селективные маркеры (например, гены устойчивости к антибиотикам) для обнаружения трансформированных клеток, содержать сайт узнавания рестриктазой в несущественной для репликации области. В качестве векторов используются плазмиды, фаги и созданные на их основе более сложные системы - фаго-плазмидные векторы, или фазмиды (например, космиды - производные плазмиды Col, El и фага X).
Включение генов в состав вектора осуществляется по-разному. Если клонируемый ген и молекула вектора содержит идентичные «липкие» концы, то они соединяются водородными связями. При отсутствии таковых, двухцепочечные концы фрагментов ДНК (гена и вектора) соединяются ферментативным путем при участии ДНК- лигазы. Сочетание гена и вектора дает рекомбинантную молекулу ДНК.
Способ введения рекомбинантной ДНК в реципиентную клетку определяется природой вектора. При использовании в качестве вектора плазмид ДНК вводится путем генетической трансформации. Если же вектором является фаг, то введение ДНК осуществляется путем трансфекции. Для повышения эффективности трансфекции в качестве реципиентов используются сферопласты бактерий, или бактерий, обработанных на холоде хлористым кальцием.
Методы генетической инженерии успешно применяются не только для конструирования организмов с новыми свойствами, но и для решения фундаментальных проблем. Генетическая инженерия помогла понять сущность непостоянства генома, связанного с присутствием мигрирующих генетических элементов, открыла новые возможности для изучения молекулярных основ онтогенеза и эволюционного происхождения разных организмов, разработала пути перестройки наследственного аппарата микро- и макроорганизмов. Реализация потенциальных возможностей генетической инженерии позволит успешно устранять наследственные заболевания человека путем исправления генетических дефектов.