Цитохимическое исследование клеток крови и пунктатов костного мозга основано на способности некоторых веществ и ферментов, участвующих в клеточном метаболизме, вступать в реакцию с определенными красителями и давать специфическое окрашивание. Наличие или отсутствие в клетке исследуемого вещества, степень активности того или иного феррита позволяют сделать определенные диагностические выводы о принадлежности клеток к тому или иному ростку. Наиболее широкое применение цитохимические исследования клеток крови находят в гематологической практике, и прежде всего для дифференциации различных форм острого лейкоза.
Цитохимическая характеристика элементов гемопоэза может быть проведена начиная со стадии морфологически распознаваемых пролиферирующих клеток (эритробласта, миелоб- ласта, монобласта, лимфобласта). При этом, при описании химических и энзимо-химических особенностей этого и других классов кроветворных клеток, предпочтение должно быть отдано реакциям, которые могут иметь диагностическое или дифференциально-диагностическое значение.
Уже в первой морфологически распознаваемой клетке гранулопоэза — миелобласте обнаруживаются все цитохимические признаки, свойственные этому ряду. В цитоплазме мие- лобластов выявляется положительная реакция при определении активности пероксидазы и хлорацетатэстеразы. При проведении PAS-реакции наблюдается диффузное окрашивание цитоплазмы, а при окраске Суданом черным В — умеренная суданофилия. В этих же клетках отмечается активность кислой фосфатазы, при выявлении которой интенсивность диффузной окраски цитоплазмы колеблется от слабой до умеренной. Как и во всех пролиферирующих клетках гранулоцитарного ряда, в миелобластах не выявляется активность щелочной фосфатазы. Реакция при определении активности неспецифической эстеразы — слабо положительная, не ингибируется фторидом натрия.
Как правило, активность разных ферментных систем, содержание гликогена и липидов увеличиваются по мере созревания клеточных элементов гранулоцитопоэза.
Нейтрофильные, эозинофильные и базофильные гранулоциты отличаются по ряду цитохимических признаков. В нейтрофильных палочко- и сегментоядерных лейкоцитах гликоген выявляется в виде отдельных гранул вишневого цвета, выполняющих цитоплазму, или диффузной интенсивной окраски. В эозинофильных лейкоцитах гликоген располагается между специфическими гранулами, которые остаются неокрашенными. В базофильных гра- нулоцитах положительная PAS-реакция после предварительной обработки мазков амилазой сохраняется. Гранулы нейтрофильных лейкоцитов окрашиваются Суданом черным В в темно-серый или черный цвет, В зрелых эозинофильных гранулоцитах центральная часть су- данотрицательная, она окрашивается в желто-коричневый цвет, а периферия — суданополо- жительная. В эозинофильных миелоцитах, метамиелоцитах, палочко- и сегментоядерных лейкоцитах активность пероксидазы и кислой фосфатазы выше, чем в соответствующих нейтрофильных клетках, но зато совершенно не выявляется активность хлорацетатэстеразы и щелочной фосфатазы, которая в норме обнаруживается в 18—54 % зрелых нейтрофильных лейкоцитов периферической крови и костного мозга. В базофильных лейкоцитах также не выявляется активность этих ферментов и пероксидазы. Нейтрофильные, эозинофильные и базофильные гранулоциты проявляют слабую или умеренную эстеразную активность при использовании в качестве субстрата а-нафтилацетата и нафтол-AS-ацетата.
В клетках мегакариоцитарного ряда с помощью PAS-реакции выявляются многочисленные гранулы, окрашенные в вишнево-фиолетовый цвет. Столь же выраженную реакцию дают и тромбоциты. Контрольный тест с амилазой указывает на то, что определяемое вещество является гликогеном. При окраске Суданом черным В липиды в мегакариоцитах не обнаруживаются. Реакции на пероксидазу, хлорацетатэстеразу и щелочную фосфатазу дают отрицательные результаты. Активность кислой фосфатазы, определяемая методом одновременного азосочетания, в клетках мегакариоцитарного ряда и тромбоцитах умеренная; она полностью подавляется при добавлении в инкубационную среду 0,05 М виннокислого калия-натрия. Приблизительно такой же уровень активности в мегакариоцитах неспецифической эстеразы, чувствительной к действию натрия фторида.
Наиболее характерным признаком моноцитов, как и всех клеток системы мононуклеар- ных фагоцитов, отличающим их от клеток остальных ростков кроветворения, является высокая активность неспецифической эстеразы, которая эффективно ингибируется при добавлении в инкубационную среду натрия фторида в концентрации 1,5 мг/мл (0,03М). В то же время этот ингибитор не оказывает влияния на более слабую активность этого фермента в других кроветворных клетках. В моноцитах крови умеренная и выраженная активность кислой фосфатазы, которая ингибируется ионами тартрата (виннокислого калия-натрия). По своей значимости в идентификации клеток системы мононуклеарных фагоцитов методика определения активности кислой фосфатазы приближается к маркерной реакции на неспецифическую эстеразу. В большей части моноцитов периферической крови выявляют активность пероксидазы, уровень которой значительно ниже, чем в наиболее молодых клетках гранулоцитарного ряда. Для большей надежности можно использовать реакцию на выявление нафтол-AS-D-хлорацетатэстеразы. При этом в молодых и незрелых клетках нейтрофиль- ного ряда всегда фиксируют окрашивание цитоплазмы разной степени, а в моноцитах реакция всегда отрицательная [Глузман Д.Ф., 1978]. В моноцитах также незначительное количество липидов и гликогена. По степени суданофилии моноциты значительно уступают клеткам гранулоцитарного ряда. При PAS-реакции в цитоплазме моноцитов наблюдают диффузное окрашивание или отложение мелких гранул по периферии клетки. Интенсивность окраски ниже, чем в зрелых гранулоцитах. Многие авторы указывают на выраженную цитохимическую гетерогенность этой группы клеток периферической крови [Глузман Д.Ф., 1978; Jansa, Papousek, 1971; Kaplow, 1975].
Лимфоциты — самые «бедные» в цитохимическом отношении клетки. Небольшая часть этих клеток содержит лишь выявляемые цитохимически гликоген (2—30 %), кислую фосфатазу и кислую а-нафтилацетатэстеразу. В них никогда не определяется активность пероксидазы и нет липидов. Вместе с тем положительная реакция на кислую фосфатазу и кислую а-нафтилацетатэстеразу и тип реакции на эти ферменты позволяют разграничить различные виды лимфоцитов.
При цитохимическом исследовании чаще пользуются полуколичественной оценкой результатов, используя принцип Астальди, основанный на выявлении различной степени интенсивности специфической окраски. В зависимости от нее исследуемые клетки делят на 4 группы; с отрицательной реакцией (—), слабоположительной (+), положительной (++) и резко положительной (+++). Для количественного выражения результатов подсчитывают 100 клеток определенного вида, дифференцируя их по степени интенсивности окраски, затем число клеток с одинаковой интенсивностью окраски суммируют и вычитают количество клеток без окраски, результат выражают в процентах. Например, при исследовании активности миелопероксидазы в нейтрофилах из 100 просмотренных клеток; в 2 — активность фермента не выявлена (—); в 3 — специфическая окраска была слабой (+); в 20 — более интенсивной (++) и в 75 — резко положительной (+++). Результат определения активности миелопероксидазы в нейтрофилах в таком случае составит; (3 + 20 + 75) — 2 = 98 %.
Результат можно выразить в виде среднего цитохимического коэффициента (СЦК) по
- Kaplow (1955). Для количественного выражения результатов подсчитывают 100 клеток определенного вида, дифференцируя их по степени интенсивности окраски, затем число клеток с одинаковой интенсивностью окраски умножают на соответствующее данной группе число плюсов, сумму этих произведений делят на 100, что и составляет СЦК. Например, при исследовании активности миелопероксидазы в нейтрофилах из 100 просмотренных клеток; в 2 активность фермента не выявлена (—); в 3 специфическая окраска была слабой (+); в 20 более интенсивной (++) и в 75 резко положительной (+-Н-). СЦК для одной клетки в таком случае составит;
(2 • 0) + (3 • 1) + (20 • 2) + (75 • 3) : 100 = 2,68.
Нормы для всех цитохимических показателей клеток необходимо разрабатывать каждой лаборатории отдельно. Это обусловлено наличием различных реактивов и степенью их чистоты.