Сверхслабое свечение, возникающее при химических реакциях, называют хемилюминесценцией. Сущность метода заключается в том, что ионы Fe2+, добавленные в систему, содержащую ненасыщенные липиды, начинают окисляться растворенным кислородом с образованием свободных радикалов воды (ОН и HO2). Это приводит к образованию перекисей липидов (ROOH), которые разлагаются присутствующими в растворе ионами Fe2+ с образованием свободных липидных радикалов (RO, RO2).
Взаимодействие радикалов RO2 между собой приводят к образованию кванта хемилюминесценции. Этот процесс имеет самоускоряющий цепной характер.
В настоящее время считают, что мембраны клеток и клеточных органелл состоят из нескольких слоев белка и заключенного между ними слоя липидов (Авцын А.П., Шахламов В.А., 1975; Губанов Н.И. и соавт., 1978). Причем, на долю липидов приходится в среднем 25-30% сухой массы мембран, и они в основном представлены фосфолипидами (Львова О.Ф., 1967; Mahrla Z. et al, 1974). В мембранах митохондрий фосфолипиды представляют 90% всех липидов, в эритроцитах около 60% (Brien J.O., 1967). Внутренняя мембрана митохондрий печени содержит меньше фосфолипидов, чем наружная (Zevy M. et al, 1967). V.Skipski (1965) выявил в мембранах большое количество свободных жирных кислот и очень мало глицеридов. По данным G.Gets, W.Bartley (1961), в фосфолипидах митохондрий из всех остатков жирных кислот 57,7% приходится на ненасыщенные жирные кислоты: олеиновая - 12,2%, линолевая - 20,6%, арахидоновая - 15,4% и т.п. Жирно-кислотный состав разных фосфолипидов клеточных мембран качественно одинаков, но имеются некоторые количественные различия.
Столь значительное количество ненасыщенных жирных кислот в мембранах клеток создает благоприятные условия для протекания реакций перекисного окисления, особенно в случаях патологии, когда ослабевают системы, регулирующие интенсивность свободно-радикальных процессов в организме.
Достоинство метода хемилюминесценции заключается в высокой чувствительности и возможности непосредственно следить за кинетикой окисления липидов без нарушения структуры объекта, в отличие от других методов, нуждающихся в предварительной экстракции липидов (Черемсина З.П., 1975; Stainley P., 1972; Seliger H., 1972; Ewets Z., 1976). Отдельными исследованиями доказана возможность использования метода спонтанной ХЛ для оценки изменений, происходящих в мышечной ткани при различных воздействиях и в условиях ее переживания (Джафаров А.И. и соавт., Тарусов Б.Н. и соавт., 1969, 1975; Гусейнов Т.М. и соавт., 1975). Единственным затруднением исследований мышечной ткани, по мнению приведенных исследователей, является очень низкий уровень спонтанного свечения.
Однако, наряду со спонтанной ХЛ биологических тканей в настоящее время применяется разработанный в лаборатории Ю.А.Владимирова метод индуцированной ионами двухвалентного железа хемилюминесценции. Об активирующей роли ионов двухвалентного железа на перекисное окисление липидов и интенсивность ХЛ имеются соответствующие данные в ряде опубликованных работ (Суслова Т.Б., 1968, 1969; Владимиров Ю.А., 1969, 1972, 1973, 1975; Ottolenghi A., 1959; Fujita T. , 1974; Meduski J. et al, 1975; Hodberg J. et al, 1975).
Следует отметить, что наиболее полно представлен ход реакций ПОЛ в биологических мембранах в присутствии ионов двухвалентного железа в работах Ю.А.Владимирова и соавт. (1972, 1975), В.И.Оленева (1978).
Процесс окисления липидов молекулярным кислородом является цепной реакцией и начинается только в том случае, если в системе появится свободный радикал (Эмануэль Н.М. и соавт., 1961). Такими радикалами, инициирующими цепное перекисное окисление липидов, могут быть радикалы воды и других веществ при действии на организм различных эндо- и экзогенных факторов. В частности, к образованию радикалов в организме приводит ионизирующее облучение, которого бывает достаточно даже в фоновых количествах (Тарусов Б.Н., 1957; Tappel A., 1965; Wills E. et al,1967). К такому же эффекту может привести облучение ультрафиолетовыми лучами (Одинокова Г.Г. и соавт., 1973; Ращупкин Д.И. и соавт., 1977).
При активировании ПОЛ ионами железа образуются радикалы воды или перекиси, которые затем разлагаются до радикалов воды. Эти образовавшиеся радикалы и дают начало реакции ПОЛ, реагируя с фосфолипидами мембран клеток в основном в местах наличия двойных связей с образованием радикалов жирной кислоты. В присутствии кислорода радикалы активно с ним взаимодействуют, образуя пере- кисные радикалы RO2. Особенность перекисных радикалов состоит в том, что они реагируют с новыми молекулами ненасыщенных жирных кислот фосфолипидов с образованием гидроперекисей ROOH и свободного радикала R. В дальнейшем, чередование реакций образования перекисных радикалов RO2 и гидроперекисей ROOH приводит к цепному самопроизвольному окислению, не требующему инициирования. Поэтому эти реакции принято называть реакциями продолжения цепи. Если бы такая цепь реакций продолжалась бесконечно, то появление одного радикала (а причин для этого достаточно) привело бы к окислению всех ненасыщенных жирных кислот фосфолипидов в организме. Однако этого не происходит в виду наличия в организме систем, препятствующих самопроизвольному бесконтрольному ПОЛ и тем самым обеспечивающим гомеостаз. К таким веществам относятся антиоксиданты или ингибиторы свободно-радикальных состояний. Антиоксидантными свойствами могут обладать различные группы веществ: а-токоферол (Tappel A., 1965; Kagan V. et al, 1973; Shimada O. et al, 1977), гормоны (Гукасов В.М., Федоров В.К., 1977), ионы железа в больших концентрациях (Владимиров Ю.А., 1975). Эффект действия антиоксидантов заключается в том, что они реагируют со свободными радикалами и препятствуют развитию цепного характера реакции ПОЛ. Если же реакция продолжается, то ионы двухвалентного железа, являясь инициаторами ПОЛ, начинают разлагать гидроперекиси ROOH с образованием новых свободных радикалов. Эта реакция называется реакцией разветвления цепи и приводит к лавинообразному нарастанию концентрации перекисных радикалов RO2, которые находясь в большом количестве в системе взаимодействуют между собой с образованием возбужденных молекул. Возбужденные молекулы образовавшихся веществ, приходя в стационарное состояние, выделяют энергию в виде квантов света, по регистрации кото-
рого судят о кинетике реакции. В целом ход реакций ПОЛ в присутствии ионов двухвалетного железы можно представить в виде следующей схемы:
ROH + R’

Математическое моделирование, проведенное Ю.А.Владимировым (1972, 1975) и В.И.Оленевым (1976) доказало, что представленная схема реакций перекисного окисления липидов и кинетики хемилюминесценции полностью совпадает с данными, полученными на ЭВМ.
Реакция перекисного окисления липидов в присутствии ионов двухвалентного железа сопровождается хемилюминес- ценцией, которая имеет определенную кинетику развития в зависимости от проходящих в единицу времени процессов в системе. Изучение кинетики ХЛ позволяет понять механизм реакций ПОЛ в тканях при различных состояниях.
Принято выделять 6 стадий, которые обозначены на типовой кривой ХЛ (по Владимирову Ю.А. и соавт., 1974), изображенной на рис. 7.
J
отд.
ЕД.

— т
отд. ЕД„
Рис. 7.
1, 2, 3... 6 стадии ХЛ окисленной линоленовой кислоты.
J - интенсивность ХЛ; t - латентный период;
Fe++ - момент введения железа.

1. “Спонтанное свечение”, характерное для систем, содержащих липиды, в которых самопроизвольно на определенном уровне идет цепная реакция перекисного окисления. Это свечение по интенсивности очень низкое и количество гидроперекисей остается на постоянном уровне.
2. “Быстрая вспышка свечения” наблюдается при введении в систему, содержащую гидроперекиси, ионов двухвалентного железа. При этом гидроперекиси быстро разрушаются с образованием перекисных радикалов RO2, диспропорцио- нирование которых сопровождается освобождением энергии в виде квантов света, что отражается на хемилюминограмме в виде пика свечения.
3. “Стадия угнетения свечения” обусловлена тем, что избыток железа, который вводится в систему, начинает проявлять себя как антиоксидант и тормозит реакции ПОЛ, что приводит к снижению количества радикалов и, следовательно, свечения.
4. “Латентный период” - время, в течение которого происходит окисление избытка железа до критического уровня. Он начинается с момента, когда исчезнут все перекиси, которые были в системе, а если их не было, то сразу после введения железа и в этом случае быстрой вспышки не наблюдается.
   

Окисление железа происходит молекулярным кислородом, наличие которого необходимо для протекания реакций. Длительность латентного периода зависит от скорости окисления железа, на которую большое влияние оказывают различные вещества, ускоряющие или замедляющие окисление железа.

5. “Медленная вспышка свечения” развивается после достижения критической концентрации железа. При этом начинается бурное разложение гидроперекисей в системе и реакция начинает протекать лавинообразно, что на кривой ХЛ выражается в виде “вспышки” свечения. На кинетику ХЛ на стадии медленной вспышки большое влияние оказывают антиоксиданты, наличие которых приводит к изменению параметром хемилюминограммы (Иванов И.И. и соавт.). Экспериментальное введение антиоксидантов в систему приводит к уменьшению угла наклона и кривые вытягиваются вдоль оси абсцисс, а медленная вспышка становится более пологой и ниже. Во время медленной вспышки, бурно проходящие реакции цепного окисления приводят к быстрому расходованию железа и падению его концентрации, что вызывает замедленное образование и постепенное уменьшение количества свободных радикалов и, как следствие, ведет к затуханию свечения (Владимиров Ю.А., 1974; Tappel A., 1959).
6. Стационарное свечение следует сразу за медленной вспышкой и обусловлено, по-видимому, низким уровнем реакций ПОЛ, которые проходят с участием трехвалентного железа, восстанавливающегося в клетке до двухвалентного (Суслова Т.Б., 1970; Владимиров Ю.А., Арчаков А.И., 1972).

Представленный механизм кинетики ХЛ позволяет выбрать наиболее оптимальные параметры для характеристики изучаемых процессов в зависимости от задач, поставленных перед исследователем.