Костный мозг. Из неповрежденного крыла подвздошной кости физиологическим раствором получают путем вымывания образцы взвеси костного мозга и помещают в стеклянные бюксы, которые транспортируют в лабораторию в термосе, заполненном толченым льдом. Затем образцы взвеси ко
стного мозга стандартизируют на микроэлектрофотоколориметре (типа МКМФ-1) до величины поглощения света 30-40%, при длине световой волны 520 нм. В препараты костного мозга добавляли два объемных процента раствора спинового зонда 2,2- 6,6-тетраметил-4-каприлоксипиперидин-один-оксила (“капри- лового эфира”) в этаноле, концентрацией 1х10-2-1х10-3 М. После инкубации в течение 10 и 40 минут образцы набирают в тонкостенный стеклянный капилляр объемом не менее 70 мкп и помещают в резонатор радиоспектрометра. Вычисляют константу скорости реакции восстановления спинового зонда костным мозгом и сопоставляют ее с графической зависимостью динамики константы в различные сроки посмертного периода. Для уменьшения вероятности возможной ошибки производят трехкратное изучение параметров ЭПР-спект- ров костного мозга на протяжении 2-3 временных интервалов. При хранении образцов взвеси костного мозга при 4- 6оС в течение трех суток и 18-20оС в течение 6 часов не оказывается существенное влияние на изменение параметров ЭПР-спектров (Прошутин В.Л., 1988).
Кровь. Периферическую кровь берут из бедренной вены с помощью шприца и инъекционной иглы в количестве 0,3 мл (для трехкратного исследования). Образцы крови можно хранить при комнатной температуре в течение 6 часов, а при температуре 4оС - до трех суток без изменения парамагнитных свойств крови и ЭПР-спектров скорости реакции восстановления спинового зонда ее (Узенева Р.Б., 1986). М.А. Оганесян (1984) рекомендует брать кровь из полости сердца, смешивать ее с гепарином в равных соотношениях. Полученную смесь разбавить физиологическим раствором в соотношении 2:5, после чего к полученному субстрату в объеме 1 мкп добавить равное количество раствора спинового зонда. Полученную смесь помещают в кварцевую ампулу и регистрируют ЭПР-спектр спиновых зондов, по которым рассчитывают константу скорости реакции восстановления спиновых зондов. Приготовление образцов крови по данной методике дает погрешность в определении константы скорости реакции восстановления до 0,1%.
Запись показаний радиоспектрометра “Рубин” производили на двухкоординатной самопишущей приставке. Постоянная температура в резонаторе радиоспектрометра, куда по
мещают исследуемый образец, поддерживается с помощью термостабилизатора “Диапазон” и равняется 29оС. Производят регистрацию сигнала спинового зонда, инкубируемого с кровью. Под действием ионов водорода (большей частью это сульфгидрильные группы белковых молекул) спиновые зонды восстанавливаются с одновременной потерей парамагнитных свойств. Скорость реакции восстановления спинового зонда в крови исследуют путем многократных записей центральной компоненты ЭПР-спектра зонда с интервалом 60 с, с последующим измерением ее амплитуды (А). В качестве спинового зонда можно использовать каприловый эфир, имеющий характерную триплетную структуру ЭПР-спектра (рис. 6).

Рис. 6. ЭПР-спектр каприлового эфира.
Условия записи могут быть при исследовании крови следующими:

• падающая мощность электромагнитного излучения 0,25 мВт;
• А - амплитуда модуляции равна 1 Гс. Использование высоких частот модуляции приводит к добавочному ушире- нию линий поглощения и искажению спектра, что уменьшает разрешающую способность системы;
• Н - диапазон развертки 3150-3200 Э.
  

С целью обнаружения резонансного поглощения в любой системе, содержащей неспаренные электроны, необходимо 4 основных компонента: а) для создания постоянного магнитного поля нужен сильный магнит, создающий стабильное однородное постоянное магнитное поле напряженностью около 3000-4000 Э (если исследование ведут при длине волны 3,2 см); б) источник микроволнового излучения, дающий монохроматические волны 1=3,2 см); в) специальное устройство, в котором падающая мощность концентрируется на образце, что позволяет обнаружить ее поглощение (обычно это полый резонатор, помещаемый между полюсами магнита); г) устройство для непрерывной записи спектров ЭПР.
Рабочие характеристики радиоспектрометра “Рубин” следующие: рабочая частота клистрона К-54, урез.=9400 МГц, частота ВЧ модуляции - умод.=100 кГц, напряженность магнитного поля H0, устанавливаемая в пределах от 2000 до 7000 Э (эрстед), диапазон развертки поля t=0,1±H , устанавливается в пределах от 5 до 1200 Э, скорость свинирования регулируется ступенчато от 5 до 500 э/мин, аттенюатор сигнала ЭПР предусматривает ослабление амплитуды сигнала от 100 до 1%, постоянная времени самописца регулируется в пределах 0,05;

0. 01; 1; 10 с.

Запись показаний радиоспектрометра производится на двухкоординатной самопишущей приставке. В регистрации сигналов от прибора используется осциллограф. Луч осциллографа и перо самописца разворачивается по оси ОХ син- фазно с разверткой магнитного поля, а по оси OY луч или перо самописца отклоняется напряжением, снятым с синхронного детектора. В качестве спинового зонда используют раствор спинмеченного 2,2-6,6-тетраметил-4-каприлоил-окси- пиперидин-один-оксила (каприлового эфира) в этаноле. Концентрация спинового зонда, растворенного в 96% этиловом спирте, на протяжении всего исследования равняется строго определенной величине 1х10-2 М.
Кровь и раствор тщательно перемешивают, смесь набирают в тонкостенный стеклянный капилляр с внутренним диаметром не более 0,5 мм. Смесь спинмеченного раствора в капилляре составляет объем не более 40 мкп. Один конец капилляра закрывают колпачком во избежание потери исследуемой смеси. Под действием ионов водорода (большей час
тью это сульфгидрильные группы белковых молекул) спиновые зонды восстанавливаются с одновременной потерей парамагнитных свойств. Как показали исследования, центральная компонента ЭПР-спектров имеет наименьшие колебания значений от воздействия факторов, не связанных непосредственно с проведением эксперимента. Условия записи спектров подбирают эмпирически с выбором оптимальных значений для сокращения величин помех, в частности:

• падающая мощность электронного излучения - 25 мВт. Контроль за изменением мощности в течение всего времени записи спектров производится образцом стандартного марганца, который также помещают в резонатор прибора. Выбор такого значения мощности обусловлен тем, что увеличение мощности может привести к так называемому явлению насыщения по мощности в ЭПР поглощения, суть которого заключается в следующем. В молекулах исследуемого вещества под влиянием микроволнового излучения резонансной частоты электроны с нижнего энергетического уровня переходят на верхний с поглощением энергии и одновременным изменением направления спина.

Одновременно с этим процессом происходит обратный, т.е. возвращение электронов на прежний уровень, так называемая индуцированная эмиссия. Суммарное количество электронов на нижнем уровне несколько выше, чем на верхнем, поэтому поглощение обычно превышает индуцированную эмиссию. Именно этот переход обусловливает резонансное поглощение. Очевидно, что если переходы между энергетическими уровнями происходят только по одному пути - поглощение и индуцированная эмиссия, то количество электронов на обоих уровнях сравнивается. Как только это произойдет, микроволновое поглощение прекратится, следовательно, исчезнет сигнал ЭПР. Данное состояние и называется насыщением по мощности, которое является фактором, снижающим точность получаемых результатов.

• амплитуда модуляции в исследованиях равнялась 0,4х10 Гс. Использование высоких частот модуляции приводит к добавочному уширению линий поглощения и искажения спектра, уменьшая разрешающую способность системы;
• диапазон развертки равняется 3150-3200 Э;
  
• скорость развертки магнитного поля и постоянная времени регистрирующего устройства подбирают так, чтобы искажение линий поглощения были минимальными.

Из приведенного следует, что для того, чтобы в любой системе, содержащей неспаренные электроны, можно было обнаружить резонансное поглощение необходимы 4 основных компонента:
а)              для создания постоянного магнитного поля необходим сильный магнит, создающий стабильное однородное постоянное магнитное поле напряженностью 3000-4000 Э (если исследования ведутся на длине волны 3,2 см);
б)              источник микроволнового излучения, излучающий монохроматические волны (1=3,2 см);
в)              специальное устройство, в котором падающая мощность концентрируется на образце, что позволяет обнаружить ее поглощение в полый резонатор, помещаемый между полюсами магнита;
г)              устройство для записи спектров ЭПР.