Замедление, а затем и прекращение окислительно-восстановительных процессов после смерти дали возможность предположить, что показателями времени наступления смерти могут быть параметры спектров ЭПР.
Основными направлениями, к которым сводится в настоящее время проблема установления давности наступления смерти, является изучение процессов, развивающихся в тканях и органах в посмертном периоде. Раскрытие этих процессов может иметь не только судебно-медицинское значение, но, в особенности в ранние сроки, и для дальнейшего развития современной трансплантологии.
Н.В.Тыглиян, А.И.Забельский, Г.А.Пашинян (1978) исследовали зависимость параметров ЭПР-спектров печени крыс, мышей и трупов людей, погибших от черепно-мозговой травмы, от давности наступления смерти. Исследованию подвергали кусочки органов, замороженные при температуре жид
кого азота. Эксперименты показали, что ЭПР-спектры крыс и мышей качественно идентичны. Регистрировали сигналы от парамагнитных центров свободных радикалов, гемового и негемового железа, Mn+2, Мо. Отличия спектров состояли в различных соотношениях амплитуд сигналов, что, по-видимому, объясняется различной интенсивностью общего обмена и энерготрат у крыс и мышей. В качестве критерия авторы предложили применить зависимость сигнала ЭПР от любого парамагнитного центра. Зависимость предложенного критерия для печени трупов людей, погибших от черепно-мозговой травмы, синбатна аналогичной зависимости для крыс в первые 18 ч. после наступления смерти. Таким образом, данные эксперимента позволяют, по мнению авторов, считать возможным использование в качестве критерия давности наступления смерти по параметрам ЭПР-спектра печени отношения амплитуды сигнала от ионов Mn+2 c g=2,14 к амплитуде сигнала от Feгем с g=2,25.
А.И.Забельский (1982) провел исследование с целью разработки научно-обоснованных критериев давности наступления смерти по скорости реакции восстановления спинового зонда и переживающих тканях и органах. Объектами исследования были печень, головной мозг и поперечно-полосатая мускулатура от трупов экспериментальных животных (беспородных крыс-самцов) числом 450. Для решения принципиальной возможности использования результатов экспериментов в экспертной практике были также изучены те же органы и ткани от трупов людей, погибших от острой черепно-мозговой травмы. Регистрацию ЭПР-спектров спиновых зондов производили на отечественном радиоспектрометре “Рубин”. Экспериментальная часть работы состояла из двух серий. В первой исследовали скорость восстановления спиновых зондов, инкубируемых с гомогенатами печени и мозга в сроки 0, 2, 4, 6, 12, 18, 24, 36 и 48 ч посмертного периода и гомогенатами мышц в сроки 0, 6, 12 и 24 ч. Далее каждые сутки в течение первых шести суток посмертного периода. Во второй серии исследований для изучения влияния алкогольной интоксикации на изучаемые параметры экспериментальным животным за 40 мин до забоя в полость желудка вводили 40% этанол из расчета 1 мл на 100 г массы животного. Изучаемые сроки и методика проведения эксперимента в
обеих сериях были аналогичными. В качестве спинового зонда был использован каприловый эфир, дающий характерный триплетный ЭПР-спектр. Изменения парамагнитных свойств в ходе реакции восстановления спинового зонда приводит к уменьшению амплитуды всех трех компонентов ЭПР-спектра зонда. Измерению подвергали амплитуду центральной компоненты ЭПР-спектра спинового зонда, так как по данным автора, она менее всего подвержена влиянию факторов, не связанных с проведением опыта.
Животных забивали путем нанесения острой черепно-мозговой травмы, после чего их трупы хранили в термостате при 18-20оС и относительной влажности 40-60%. Органы и ткани от трупов животных брали в строго определенные сроки посмертного периода (см. выше) и в герметичных ампулах помещали в холодильник, где хранили при -5оС в течение 12 суток. Непосредственно перед исследованием органы размораживали и из них готовили гомогенат в 0,25 М растворе сахарозы. Затем определенный объем гомогената смешивали в отношении 1:1 со спиртовым раствором спинового зонда и запаивали в тонкостенную стеклянную ампулу, которую помещали в резонатор радиоспектрометра. В исследованиях тканей печени и мозга материал был не менее чем от 10 трупов животных, а мышечной ткани - от 5.
Результаты исследований А.И.Забельского показали, что имеется определенная динамика скорости реакции восстановления спинового зонда гомогенатами тканей, зависящая от времени, прошедшего после наступления смерти. Причем, динамика не носит прямо пропорциональный характер, а имеет общий для тканей печени и мозга вид, характеризующийся двумя пиками подъема и двумя пиками спада активности восстанавливающих систем как при наличии, так и в отсутствие алкоголя в организме. Наряду в этим выявлены значительные расхождения значений максимумов пиков как во временном аспекте, так и в значениях константы скорости реакции восстановления спиновых зондов.
Влияние алкогольной интоксикации сказывалось в основном в первые сутки посмертного периода, что выражалось в смещении пиков активности реакции восстановления и изменения значений константы как таковой. Исследование мышечной ткани показало наличие совершенного иных резуль
татов, отличающихся от данных исследования тканей печени и мозга. В обеих сериях экспериментов в течение первых трех суток посмертного периода автором не были отмечены достоверные изменения константы скорости реакции восстановления зонда, что впервые было выявлено на четвертые сутки посмертного периода. В течение следующих пятых и шестых суток отмечен достоверно значительный рост константы скорости реакции восстановления спинового зонда. Такую динамику восстановления в тканях печени и мозга автор пытался объяснить следующими данными. Так, параметр “К”, пропорциональный константе скорости восстановления спинового зонда, отражает состояние электрон-триплетных цепей в переживающих тканях. Естественно, что при посмертной ишемии и аноксии происходит резкое нарушение метаболизма тканей и связанное с этим нарушение донорно-ак- цепторного состояния тех цепей переноса электронов, для которых конечным этапом является спиновый зонд. Одним из факторов, приводящих к изменению константы скорости реакции восстановления может быть отек, поскольку нарастание его приводит к увеличению межмолекулярных промежутков и к конформационным изменениям белков, что снижает их доступность для спинового зонда. Увеличение отека к 6 и 36-ти часам посмертного периода в селезенке и миокарде наблюдали в своих исследованиях В.Н.Ворошко (1975) и Г.М.Мирошник (1976). Увеличение скорости реакции восстановления спинового зонда к четырем и шести часам посмертного периода, по-видимому, связано с интенсивно протекающими в этот срок процессами распада мембран митохондрий и выходом специфических митохондриальных ферментов, восстанавливающих спиновые зонды (Покровский А.А. и соавт., 1971). Вторичный подъем активности реакции восстановления спиновых зондов к концу первых суток связан, по мнению автора, с нарастающими явлениями клеточного распада и увеличением количества восстанавливающих агентов. Специфическая динамика реакции восстановления, полученная А.И.Забельским при исследовании гомогенатов мышечной ткани, а именно отсутствие таковой в первые трое суток и последующий ее рост с четвертых на пятые и шестые сутки связано, по-видимому, с низким восстановительным потенциалом мышц, зависящим от их морфо-функциональных
особенностей и довольно поздно развивающимися явлениями аутолиза, достигающими на четвертые сутки такой степени, что их можно зафиксировать с помощью метода электронного парамагнитного резонанса.
При исследовании тканей организма, подвергнутого прижизненному воздействию алкоголя, автор выявил достоверные отличия от тканей в отсутствие алкоголя (Plt;0,001). Достоверность различия снижалась с увеличением времени, прошедшего после наступления смерти. Высокий коэффициент различия констант скорости реакции восстановления спиновых зондов тканью печени после первых суток посмертного периода и констант других изучаемых тканей в исследуемые временные промежутки позволило автору предложить его в качестве дополнительного критерия для учета влияния алкогольной интоксикации.
Для решения вопроса о принципиальной возможности применения метода ЭПР в экспертной практике, а также с целью его апробации для нужд судебной медицины А.И.За- бельский исследовал ткани печени, мозга и скелетной мускулатуры от трупов людей, погибших от острой черепно-мозговой травмы, время смерти которых было заведомо известно из сопроводительных документов.
Исследования экспертного материала автор проводил по той же методике, что и экспериментальный, однако изучаемые сроки посмертного периода были иными. Гомогенаты тканей печени и мозга исследовали через 12, 24, 48, 72, 96, 120 и 144 часа после смерти. Кусочки тканей хранили до начала исследования в герметически закрытых банках. Исследования показали наличие достоверной динамики константы скорости реакции восстановления спиновых зондов, принципиально сходную с результатами, полученными при экспериментальных исследованиях, и характеризирующуюся также двумя максимумами подъема восстанавливающей активности тканей к 24 и 144-м часам посмертного периода. Исследования мышечной ткани были проведены в те же сроки, что и печени и мозга. Однако, в связи с тем, что гомогенаты мышечной ткани не вступали в реакцию восстановления со спиновыми зондами вплоть до пятых суток посмертного периода автором были проведены исследования на 6, 10, 15, 20, 25 и 30-е сутки после наступления смерти. Результаты ис
следования мышечной ткани показали, что имеется достоверный рост значений константы скорости реакции восстановления спиновых зондов, начиная с шестых суток посмертного периода по 25-е сутки включительно, после чего наступал спад к 30-м суткам.
Автором продемонстрирована принципиальная схожесть динамики реакции восстановления спиновых зондов в исследованиях, проведенных на тканях и органах экспериментальных животных и взятых от трупов людей. Разница заключалась в сдвиге по времени пиков максимальной активности восстанавливающихся систем и абсолютных значений константы “К”. Это можно было объяснить различиями интенсивности окислительно-восстановительных процессов в тканях экспериментальных животных и человека и по-разному протекающими процессами гниения.
Таким образом, А.И.Забельский установил, что константа “К”, пропорциональная скорости реакции восстановления спинового зонда является объективным критерием давности наступления смерти. Для получения максимально точных и надежных результатов целесообразно исследовать сразу несколько органов, поскольку динамика константы скорости восстановления носит волнообразный характер и возможно совпадение значений в различные временные промежутки. Следует проводить трехкратное исследование хранящихся образцов через определенные промежутки времени для выяснения наличия положительной или отрицательной динамики в реакции восстановления спинового зонда, после чего можно достоверно установить наступление смерти по калибровочным графикам. Соблюдение этого условия позволяет устанавливать сроки посмертного периода по гомогенатам печени и мозга в течение первых 48 ч с точностью 4-6 ч и далее по гомогенатам мышечной ткани с точностью до 24 ч в первые 5 суток в эксперименте. Данные, полученные при исследовании экспертного материала дают основание полагать о целесообразности применения метода в поздние сроки (до 30 суток), с точностью до 5 суток. Наличие алкогольной интоксикации оказывает определенное влияние на динамику окислительно-восстановительных процессов в переживающих тканях, что необходимо учитывать преимущественно в первые сутки посмертного периода.
С учетом относительной простоты методики, высокой точности, а также возможности проведения исследования в поздние сроки посмертного периода (до 30 суток) А.И.Забельс- кий пришел к выводу, что способ установления давности наступления смерти по скорости реакции восстановления спинового зонда гомогенатами тканей можно считать перспективным и рекомендовать его в экспертную практику.
Метод ЭПР был также применен другими исследователями с целью разработки объективных критериев давности наступления смерти. Так, О.А.Азизова и соавт. (1981) изучали интенсивность сигнала ЭПР с g=2,03, обусловленного нитроксильны- ми комплексами, возникающими при обработке печени NaNO2. Интенсивность сигнала ЭПР изменялась в различные сроки посмертного периода, что позволило авторам высказать мнение о возможности применения указанного метода при судебно-медицинском установлении давности наступления смерти в ранние сроки (до 6 часов). Результаты этой работы позволили предположить, что образование нитроксильных комплексов связано с разрушением мембранных структур клеток, интенсивно протекающим в клетке через 2 ч после смерти.
Была также исследована кинетика реакции скорости восстановления спиновых зондов гомогенатами печени в зависимости от срока наступления смерти, типа спинового зонда, типа растворителя (Тыглиян Н.В., Пашинян Г.А., Забельский А.И., 1981). Исследования показали, что восстановителями в основном являются SH-группы белков. Зависимость константы скорости реакции восстановления спиновых зондов от давности наступления смерти установлена как изменением числа SH-групп, так и разрушением мембран субклеточных орга- нелл в посмертном периоде.
По мнению Г.А.Пашиняна и Н.В.Тыглияна (1982), на скорость процессов аутолиза оказывает влияние причина смерти. Этот факт был установлен методом ЭПР при исследовании динамики посмертного аутолиза печени интактных и адреналэктомированных животных. Учитывали и продолжительность агонального периода. Как объяснили авторы, гормоны неодинаково влияют на мембрану субклеточных орга- нелл в течение агонального периода.
Динамика посмертного аутолиза тканей животных и человека методом ЭПР была исследована и в других работах.
Выявлена четкая зависимость параметров ЭПР-спектров тканей от срока давности наступления смерти. При изменении температуры внешней среды от 20 до 45оС ход этой зависимости достоверно изменялся - происходит сдвиг во времени экстремальных точек. Данные экспериментов позволили авторам считать, что процесс посмертного аутолиза является ферментативным процессом, замедляющимся в ближайшие сроки после наступления смерти из-за возникновения в тканях гипок- сических условий, а в дальнейшем резко усиливающимся.
Таким образом, по мнению исследователей, существует принципиальная возможность применения метода ЭПР при решении вопросов о давности наступления смерти в экспертной практике.