Метод ЭПР дает возможность регистрировать с помощью электронных устройств уменьшение мощности электронного сверх частотного излучения (сантиметровые и миллиметровые радиоволны), подаваемого на вещество, помещенное в однородное магнитное поле определенной напряженности. Уменьшение мощности проходящих через исследуемый образец радиоволн обусловлен поглощением части энергии излучения электронами вещества. Однако не все электроны могут быть исследованы при помощи метода ЭПР. Он может быть применен только к химическим системам, содержащим электроны с некомпенсированными спиновыми моментами, где, как правило, содержится нечетное количество электронов. Таким образом, ЭПР-спектроскопия имеет то преимущество, что только парамагнитные молекулы (или частицы с неспаренными электронами) в образце могут взаимодействовать с соответствующими внешними полями в условиях резонанса.
Метод дает возможность выявить неспаренные электроны даже при незначительной их концентрации в любом веществе, не изменяя его, охарактеризовать их энергетическое состояние и локализацию.
Для регистрации сигнала ЭПР необходимо следующее:

• создать однородное магнитное поле, достаточно высокой напряженности;
• иметь монохроматическое микроволновое электромагнитное излучение;
• сконцентрировать это излучение на образце, полученный сигнал продетектировать, усилить и зарегистрировать на самопишущем устройстве.

За счет энергии излучения неспаренные электроны, находящиеся на более низком энергетическом уровне, переходят на более высокий. Соответственно происходит изменение направления спина. Такое поглощение энергии электронами при переходе на верхний уровень может быть обнаружено по изменению мощности электромагнитного излучения и зарегистрировано каким-либо способом, принятым в радиоспектроскопии. Разница в заселенности двух уровней и определяет интенсивность сигнала ЭПР, являясь параметром, определяющим рабочую чувствительность радиоспектрометра. Распределение электронов на двух энергетических уровнях можно описать выражением Максвелла-Больцмана:
N _              - hv
n2 _e kT ,              (9)
где N1 и N2 - число электронов на верхнем и нижнем уровнях соответственно; k - постоянная Больцмана; T - температура. Отсюда разница между N1 и N2 будет тем больше, чем больше hv, следовательно, и напряженность магнитного поля

8. Поэтому ЭПР-спектрометры должны работать при возможно более высоких значениях напряженности магнитного поля и микроволновой частоты (Ингрем Д., 1972; Робертсон Б., 1985).

На рисунке 3 приведена принципиальная схема устройства радиоспектрометра ЭПР по Л. Берлинеру (1979). Основными частями этого прибора являются: клистрон (источник микроволнового излучения), двойной Т-мост (или микроволновый циркулятор), резонатор, блок детектора, усилитель и
записывающее устройство. Клистрон, стационарный вентиль и регулирующий аттенюатор являются источниками переменного микроволнового излучения.

Рис. 3. Схема ЭПР-спектрометра (основные части). (Л.Берлинер, 1979).
Спектрометр сконструирован так, чтобы величины сопротивлений плеч 2 и 4 были хорошо сбалансированы и чтобы на детектор на плечо 3 падала очень низкая мощность. В ре-
зонаторе образец расположен в области с высоким значением напряженности микроволнового поля H1. Частота клистрона в ходе экспериментов остается постоянной, а величина магнитного поля изменяется. В условиях резонанса образец поглощает микроволновую энергию. Создается разбаланс моста, который детектируется как увеличение мощности на плече 3, усиливается и выносится на самописец. Катушки модуляции превращают постоянный сигнал в переменное напряжение, которое может усиливаться с помощью фазочувствительного титрования. Модуляция дает возможность проводить дополнительную регулировку интенсивности сигнала ЭПР путем изменения ее амплитуды.
Приводим также принципиальную схему устройства радиоспектрометра ЭПР типа “Рубин” отечественного производства (рис. 4).

Рис. 4. Принципиальное устройство радиоспектрометра “Рубин”.
В этом приборе источником микроволнового излучения служит также клистрон, который представляет собой вакуу- мированную трубку, способную генерировать микроволновые колебания в узком диапазоне частот. Зависимость снимаемой мощности от частоты описывает зону генерации клистрона. Частота монохроматического излучения задается напряжением, приложенным к клистрону. Клистрон можно подстро-
ить на любую частоту в пределах зоны. Для стабилизации частоты клистрона имеется автоматическая система контроля частоты. От клистрона микроволновое излучение по волноводу подается в полость резонатора, где оно максимально концентрируется. Таким образом, на образец подается достаточно мощное осциллирующее микроволновое магнитное поле. Резонатор представляет собой центральную часть радиоспектрометра. Его работа сходна с работой акустического резонатора. Отражение звуковых волн от стенок акустического резонатора приводит к их погашению в результате интерференции тех волн, для которых половина длины волны не кратна ни одному из размеров резонатора. Частота, при которой половина длины волны соответствует одному из размеров резонатора называется основной резонансной частотой. Ее можно регулировать, измеряя внутренний объем резонатора. Объемный резонатор можно возбудить так, чтобы в нем создались стоячие волны, которые могут дать значительную концентрацию энергии. В микроволновом резонаторе, в отличие от акустического, следует учитывать наличие как электрического, так и магнитного полей.
В качестве детектора чаще всего применяют кремниевый кристалл, функционирующий как микроволновый выпрямитель. Отрицательным действием детектора является то, что при его работе появляется большое количество низкочастотных шумов, отрицательно сказывающихся на работе прибора. Для исключения шумов требуются довольно сложные приемы. Качество детектирующего устройства и является критерием, определяющим высоту классности прибора.
Таким образом, величина тока, идущего через детектор, является мерой отраженной мощности внутри резонатора в любой момент времени. Если внутри резонатора имеет место поглощение, то ток детектора соответственно уменьшается. Внешнее магнитное поле создается, как правило, электромагнитом, так как для получения резонанса пользуются обычно изменением магнитного поля, а не частоты. Для измерения поля в радиоспектрометрии прибегают к модуляционным методам, основанным на применении колеблющегося магнитного поля, многократно проходящего через точку резонанса. В результате на детекторе создаются низко- и высокочастотные колебания, которые можно усилить
с помощью обычных радиосхем и наблюдать на осциллографе. Простейшая форма такой модуляции показана на схеме 2 и заключается в том, что на магнитное поле накладывают низкочастотную развертку, создаваемую модуляционными катушками и подают на временную развертку осциллографа, одновременно подавая на вертикально отклоняющие пластины усиленный сигнал детектора.
В регистрации сигналов от прибора используют осциллограф и двухкоординатный самописец. Луч осциллографа и перо самописца разворачивают по оси OX синфазно с разверткой магнитного поля, а по оси OY луч и перо отклоняются напряжением, снятым с синхронного детектора.
В качестве объемного резонатора в радиоспектрометре “Рубин” применяется цилиндрический объемный резонатор с типом колебаний H011. Исследуемый образец помещают в стеклянной или кварцевой ампуле вдоль оси резонатора, что соответствует его размещению в пучности магнитного поля.
Рабочие характеристики радиоспектрометра “Рубин” следующие: рабочая частота клистрона K-54v =9400 МГц, частота ВЧ модуляции пмод=100 кГц, амплитуда модуляции регулируется ступенчато от 0,01 до 10 Гс, напряженность магнитного поля Ho устанавливается в пределах от 2000 до 7000 Э, диапазон развертки поля t=0,1±H устанавливается в пределах от 5 до 1200 Э, скорость свипирования регулируется ступенчато от 5 до 500 Э/мин., аттенюатор предусматривает ослабление амплитуды сигнала ЭПР от 100 до 1%, постоянная времени самописца регулируется в пределах 0,03, 0,01, 1, 3 и 10 с.
Константу скорости реакции восстановления рассчитывают методом наименьших квадратов.
Поскольку константа скорости реакции восстановления равна:
(10)
то по методу наименьших квадратов получают формулу:
I- in
У A ,0
n              ,              (11)
lnO2
Если в опыте промежутки времени инкубации составляют 4 мин и регистрируются через четыре значения амплитуды в сроки 0, 4, 8 и 12 мин; то формула для расчета константы скорости преобразуется к виду:
K = GlnAo -lnAj -2lnA2 -3lnA(c -1),              (12)
где A0, A1, A2 и A3 - значения амплитуд в сроки инкубации

0. 4, 8 и 12 мин, соответственно.

Погрешность в определении значения амплитуды не превышает 0,5%, что приводит к неточности в определении константы скорости реакции восстановления не более 1,5%.
Полученные значения констант для каждой серии в определенной группе наблюдений обрабатывают общепринятыми статистическими методами. Рассчитывают среднее значение, погрешность среднего. Сравнение средних значений констант внутри групп, между сериями и между группами проводят по формуле:
М - М2
t =              1              —
2 ,              (13)

1. mT + m2

Полученное значение t сравнивают со значением для уровней 0,05 и 0,01.
Для исследования методом ЭПР обычно применяют нит- роксилрадикалы, которые характеризуются относительной стабильностью. Это обеспечивается низким уровнем энергии основного состояния нитроксильной группы NO (gt;No-O), содержащей неспаренный электрон, и защитным действием, создаваемым метильными группами. Эти соединения дают спектры в виде трех узких, хорошо разделенных и легко трактуемых линий сверхтонкой структуры за счет взаимодействия неспаренного электрона с ядерным спином азота.
Неспаренный электрон в стабильных нитроксильных радикалах практически полностью локализован на NO-группе радикала. Поэтому нитроксильные радикалы являются одним из немногих классов свободных радикалов, которые участвуют в реакциях без затрагивания свободной валентности. Возможность таких реакций определяет широкий ассортимент спиновых зондов и меток.
К исчезновению парамагнитных свойств описанных нитроксильных радикалов приводят реакции восстановления- окисления.
Реакции восстановления радикального фрагмента протекают эффективно, когда в среде присутствует не только донор электронов, но и донор протонов: gt;No-O+H++e®gt;N-OH. В среде, содержащей протоны, донорами электронов могут быть соединения органического и неорганического происхождения, обладающие достаточно высоким восстановительным потенциалом. Таким свойством обладает гидрохинон, гидразин, соединения с сульфгидрильными группами и другие. Если реакция восстановления происходит в водной среде, в роли доноров протонов могут выступать молекулы воды.
Реакция окисления радикального фрагмента происходит в присутствии достаточно сильных окислителей, например, галогенов:
gt;No-O+RClogt;gt;N+-OH-RCl.
Если в исследуемой среде наряду с нитроксильными присутствуют другие активные углеводородные радикалы R, возникшие в результате деструкции молекул вещества или в процессе других реакций, то они могут реагировать с нитроксильными радикалами:
gt;No-O+Rogt;gt;N+-H-R.
В качестве спиновых зондов также могут быть использованы парамагнитные ионы переходных металлов, ионы лантаноидов и некоторые органические радикалы. Спиновый зонд чувствителен к таким свойствам окружения, как молекулярное движение, ориентация, локальное электрическое и магнитное поле. Он может регистрировать самые незначительные изменения в биологических структурах при их функционировании или при различных воздействиях на них (Кузнецов А.Н., 1976).