ЭПР - это очень чувствительный метод, позволяющий проводить измерения с достаточно малыми количествами образца, который к тому же не обязательно должен быть гомогенным.
Первые работы, посвященные исследованию биологических объектов методом ЭПР, были опубликованы почти через 10 лет после открытия эффекта (Commoner B., Taunsend J.F., Pake J., 1954; Блюменфельд А.Н., Колмансон А.Э., 1957).
В качестве примера рассмотрим исследование с помощью ЭПР печени крысы. Небольшой кусочек печени (несколько миллиграммов) помещают сразу же после изъятия в жидкий азот; эта процедура способствует повышению точности измерений и предотвращает разложение ткани. Наблюдаемые линии можно идентифицировать, определив g-фактор:

• если gs2, то в образце присутствуют либо свободные радикалы, либо ионы переходных металлов с орбитальным моментом электронов L=0;
• если g-фактор сильно отличается от 2, это почти наверняка означает что в образце имеются ионы переходных металлов с L^0.

Проводя более обстоятельные исследования, обычно удается установить локализацию и природу источника сигнала.
Локализация. Ткань гомогенизируют, подвергают дифференциальному ультрацентрифугированию и исследуют каждую фракцию с помощью ЭПР:

• ядра клеток дают едва различимый сигнал в области g=2;
• плазматические мембраны не дают никакого спектра;
• надосадочной жидкости соответствует слабый сигнал в области g=2;
• митохондрии дают несколько линий, расположенных в интервале 1,5lt;glt;3;
• микросомы (мембранные пузырьки) дают очень интенсивный сигнал из трех линий с g=2,42; 2,27 и 1,9, который наблюдается и в спектре исходного образца.

Таким образом, ЭПР-поглощение тканей связано в основном с окислительно-восстановительными системами клетки (митохондриями и микросомами).
Идентификация парамагнитных центров. Разумеется, наиболее эффективным способом анализа было бы изучение
очищенных и изолированных компонентов ткани, однако из- за большого их числа и нестабильности свободных радикалов этот путь оказывается нереальным, и приходится основываться на косвенных данных.
При восстановлении микросом дитионитом наблюдается уменьшение интенсивности всех трех линий. Это дает основание полагать, что источником этих сигналов служит одно вещество (вероятность такого эффекта для смеси весьма мала). Исходя из спектров поглощения, удалось установить наличие в микросомах двух типов цитохрома - Р450 и Ь5. Кроме того, было известно, что содержание цитохрома Р450 в тканях печени увеличивается, если животному на протяжении некоторого времени вводить фенобарбитал. Оказалось, что имеется четкая корреляция между эффектами возрастания интенсивности сигналов ЭПР и поглощения, с одной стороны, и количеством введенного фенобарбитала - с другой. Таким образом, было установлено, что сигналы ЭПР микросом обязаны своим происхождением цитохрому Р450.
Цитохром Ь5 при 77 K дает слишком широкий сигнал, чтобы его можно было зарегистрировать в спектрах ЭПР микросом (надежные данные удается получить лишь при температуре жидкого гелия, 4 K).
Исследование митохондрий с помощью ЭПР гораздо сложнее из-за большого числа линий в спектре. По этой причине удается идентифицировать лишь часть сигналов суммарного спектра ЭПР. Например, линия с g=2,003 может быть в apriori отнесена как к свободному радикалу, так и к иону металла. Время релаксации для свободных радикалов значительно больше, чем для ионов металлов. Следовательно, для выяснения природы сигнала с g~2 необходимо проводить эксперименты по насыщению. Для свободных радикалов интенсивность сигналов ЭПР пропорциональна мощности микроволнового излучения лишь при малых ее значениях. Для образцов из ткани печени уменьшение мощности ведет к пропорциональному уменьшению интенсивности всех сигналов, кроме сигнала с g=2,003, который, кроме того, становится узким и симметричным. Таким образом, этот сигнал можно приписать свободным радикалам.
С помощью ЭПР были обнаружены свободные радикалы во многих биологических системах как растительного, так и
животного происхождения. К тому же была установлена корреляционная связь между концентрацией свободных радикалов и метаболической активностью исследуемого материала, что явилось подтверждением выдвинутого ранее предположения об участии свободных радикалов в процессах обмена веществ. Однако, основной трудностью явилось то, что по ряду причин, связанных в основном со спецификой протекания метаболических процессов в биологических тканях и высоких диэлектрических потерь, не удалось ответить на вопрос, какие именно свободные радикалы участвуют в тех или иных конкретных процессах обмена. Несмотря на указанные трудности, в некоторых областях биологии методом ЭПР-спектроско- пии были получены интересные результаты.
Еще в середине 50-х годов в биологии возникла необходимость в экспериментальных исследованиях на уровне электронных процессов. Высказывались обоснованные предположения об участии в биоэнергетике, фотосинтезе, первичных радиобиологических процессах и в других реакциях электронов, атомов, ионов, фрагментов молекул, содержащих неспаренные электроны.
Главная причина такого широкого использования метода ЭПР заключалась в простоте анализа спектров с помощью магнитных параметров, их интерпретации на основе молекулярных структур, высокой чувствительности спектральных характеристик к электронному распределению, молекулярной ориентации, природе окружения и молекулярным движениям.
Сразу же при использовании метода ЭПР в изучении ли- офилизированных тканей животного, растительного происхождения и микробных клеток было обнаружено, что парамагнетизмом обладают почти все биологические объекты (Ажипа Я.И., 1983).
К одним из первых работ по изучению свободных радикалов методом ЭПР относятся также исследования, проведенные в лаборатории Горди в 1955 году (Gordy W., Ard W., Shields

8. , 1955). Для биологических исследований особый интерес представляют свободные радикалы, образующиеся в процессе обычных метаболических реакций. Однако, отдельные работы на биологическом материале были проведены с применением рентгеновского облучения, действию которого подвергались аминокислоты и белки. Возникающие при этом
   спектры были тщательно изучены. Аналогичным образом исследованы шелк-сырец, цистеин, волосы, ногти. В частности, полученный спектр шелка-сырца состоял из одного дублета, расположенного симметрично относительно g-фактора свободного электрона, в отличие от него спектры цистеина и кератиновых структур в значительной степени ассиметричны относительно g-фактора свободного электрона. Значения g- фактора свободных радикалов органических веществ всегда очень близки к значениям g-фактора свободного электрона, так как у них спин-орбитальная связь очень мала. Обычно атомы кислорода и серы могут довольно значительно сдвигать значения g-фактора, если неспаренные электроны будут с ними активно реагировать. Это дало возможность Горди, Арду и Шилдсу предположить, что наиболее вероятной ассимет- рии спектров ЭПР цистеина и кератинов является миграция неспаренных электронов и вакансий, образующихся под действием рентгеновского облучения, на атомы серы и водорода с последующей локализацией на этих атомах.

Дальнейшие исследования в целом подтвердили эти результаты (Gordy W., Kusita J., 1960). В этот же период времени был выполнен ряд исследований по интерпретации спектров ЭПР при рентгеновском облучении дипептидов и полипептидов. Проведены систематические исследования структуры монокристаллов белков и аминокислот, целью которых является дальнейшая расшифровка строения молекул белка и локализация в них свободных радикалов.
Исследования фрагментов и различных ферментативных реакций могут служить иллюстрацией различных практических приложений ЭПР. Это связано с тем, что практически все ферментные реакции можно охарактеризовать тремя основными свойствами, регистрируемыми методом ЭПР. Большая часть ферментов содержит в своей структуре ионы металлов (Fe, Mn, Ca и др.), которые в процессе ферментативных реакций меняют свою валентность, что частично связано с высвобождением неспаренных электронов в окружении иона металла, а это можно фиксировать и охарактеризовать с помощью метода ЭПР. Механизм ферментативной активности по своей природе является каталитическим, что имеет прямое отношение к кинетике химического превращения. Метод ЭПР является очень полезным в этой области, так как позволяет
непрерывно следить за быстрыми изменениями концентрации свободных радикалов, причем одновременно, т.е. дает возможность следить за последовательностью реакции.
Исследованию подвергались все основные группы ферментов: гидролитические, фосфолитические, окислительные (дегидрогеназы, оксидазы, окислительные дезаминазы, ферменты, катализирующие присоединение; ферменты, катализирующие реакции переноса групп; изомеризующие ферменты). Не вдаваясь в подробности довольно сложных методик, следует отметить, что на разных стадиях проведения экспериментов основное внимание фиксировалось на изучение концентраций начальных и конечных продуктов реакций (Nuchaelis Z., Menten M.Z., 1913).
В этих исследованиях ЭПР приобретает особое значение в связи с тем, что дает информацию о промежуточных продуктах каталитических реакций, так как они обычно содержат неспаренные электроны. Структура и механизм действия большинства ферментов крайне сложен и лишь в немногих случаях выяснен окончательно.
Многие из проводимых работ по изучению парамагнитных центров, присутствующих в активно метаболизирующих объектах, либо возникающих при различных физических и химических воздействиях, связанных с применением метода ЭПР.
Несмотря на распространенность парамагнитных центров в природе, значительная часть биологических веществ их не содержит. Ткани, изучаемые с помощью метода ЭПР, вследствие поглощения магнитной энергии водой, должны подвергаться особой обработке для исключения этого фактора, а нарушение нативной структуры веществ вносит определенную ошибку в результаты исследования.
В молекулярной биологии имеются методы и подходы, основанные на использовании новых молекулярных датчиков

• стабильных нитроксильных радикалов, связанных ковалентно с макромолекулой (спиновые метки) или введенные в систему в виде ничтожных примесей (спиновые зонды). Изменение парамагнитных свойств нитроксильных радикалов, введенных в биологическую систему, в результате взаимодействия с последней, можно зарегистрировать с помощью магнитной радиоспектрометрии. Спиновые зонды и метки четко реагируют на малейшие изменения функции биологических
  структур. В связи с этим диапазон проводимых с их помощью исследований в биологии и медицине расширяется.

Исследование реакции скорости восстановления нитро- ксильных радикалов в нативных тканях имеет значительные трудности для дальнейшей расшифровки данных. Поэтому для проведения исследований подобного рода чаще применяются искусственно созданные среды. Известно, что аскор- бат натрия восстанавливает нитроксильные группы до магнитных продуктов, предположительно до гидроксиламинов. Скорость восстановления нитроксилов зависит от наличия того или иного защитного окружения. Этот метод использован для изучения диффузии фосфолипидов из внутреннего монослоя бислойных великул во внешний монослой (Kornberg R.D., McCannel, H.M., 1971). Подобным образом по скорости восстановления нитроксилов можно исследовать скорость проникновения иона аскорбата в ориентированные бислои фосфолипидов, содержащие спиновые зонды, и таким образом оценивать относительную глубину погружения в бислой нит- роксильных фрагментов спиновых зондов. Для данного спинового зонда относительные значения скорости восстановления служат индикаторами проницаемости биослоя в разных уровнях (Butler K.W., 1975; Scheier-Mucclo S., Marsh D., Smith

9. C.P., 1975). Методом наблюдения за скоростью восстановления спиновых зондов аскорбатом натрия было измерено влияние кальция и тетракаина на проницаемость липидных клеток. И кальций, и тетракаин повышали проницаемость липидов для аскорбата натрия с пленками из липидов белого вещества бычьих мозгов, причем их воздействие было аддитивным. Влияние кальция и тетракаина на проницаемость изменялось в зависимости от типа липида, из которого готовили пленку.

Не только аскорбат (Kornberg R.D., McConnell H.M., 1971) и глютатион (Morrisett J.D., Drott H.B., 1969) способны восстанавливать нитроксильные радикалы, что приводит к потере парамагнетизма. Этим свойством обладают и некоторые ферменты. Так, кинетика восстановления спин-меченного фосфата и 5-доксилстеариновой кислоты микросомальными мембранами, содержащими гидроксилирующую ферментную систему их цитохрома Р450 и цитохром Р450-редуктазы, была изучена зарубежными исследователями (Stier A., Sackmen E.,
1973). Исследования, проводимые с помощью спиновых меток со времен первых работ Мак Коннела и соавт. (Ziebling

7. R., McConnel H.M., 1965; Hood D.E., McConnell H.M., 1962), благодаря их высокой эффективности и методической простоте стали одним из основных инструментов исследования биополимеров и биомембран. Основные усилия метода спиновых меток направлены на решение фундаментальных вопросов ферментативного катализа и физической химии белков. Метод позволяет исследовать топографию белковой поверхности, конформационные переходы, локальную подвижность и микровязкость белковой матрицы, строение и динамику активных центров.

Значительные успехи были достигнуты в изучении методом ЭПР участия свободных радикалов в процессах биосинтеза АТФ и биотрансформации энергии в клетках животных и растений. Получены данные о механизмах фотосинтеза, радиолиза сложных полимеров.
Метод спиновых зондов обязан своим появлением на свет успешным работам по синтезу стабильных нитроксильных радикалов. Спиновые зонды служат своеобразными репортерными группами, которые чутко реагируют на малейшие изменения конформации макромолекул при их функционировании или при различных воздействиях на них. Вращательная трансляционная подвижность спиновых зондов, измеренная с помощью техники электронного парамагнитного резонанса дает информацию о структуре, конформационной динамике, микрорельефе и топологии исследуемых объектов. По мнению M.Burr и D.E.Koshland (1964), такая репортерная группа должна обладать следующими свойствами:

1. она должна, будучи введенной в определенные участки изучаемой системы, сообщать по изменению собственной структуры о характере ее окружения;
2. ее регистрируемые свойства должны быть уникальными или резко отличаться от свойств исследуемой системы;
3. репортерная группа не должна оказывать влияние на изучаемую систему, но сообщать о всех ее изменениях.

Первый нитроксильный радикал был известен уже более 100 лет назад как нитроксидисульфонат калия (соль Фреми):
Она представляет собой довольно нестойкое соединение, сохраняющееся в обычных условиях в течение нескольких
суток. Поэтому соль Фреми не могла быть использована для создания методик, но иногда применяется в качестве спинового зонда.
Соль Фреми

О
Химические свойства нитроксильных радикалов определяют их поведение в исследуемых объектах и служат для создания специфических приемов с их применением.
S.Ohnishi и H.M.McConnell (1965) и O.H.Offith,

8. M.McConnell (1965) установили, что наиболее удачным видом спинового зонда являются свободные радикалы, содержащие группу NO в соединении с третичными углеводородными атомами, где R1 и R2 - группы, связывающие их с биологической молекулой. Эти группы могут быть различными, что позволяет спин-метке избирательно прикрепляться к отдельным участкам молекулы.

Связь между спин-меткой и изучаемой молекулой может быть достаточно жесткой, так что группа NO будет не подвижна относительно самой молекулы, или эта связь будет слабой и группа NO может двигаться относительно свободно. Этим двум видам связей будут соответствовать и различные виды ЭПР-спектров. ЭПР-спектры, содержащие не подвижные группы NO будут обладать широкими линиями поглощения, в то время, как линии со спектрами, приближающимися по характеру к спектру свободной спин-метки в растворе будут узки
ми. Следовательно, ширина наблюдаемой линии поглощения свидетельствует о природе связи спиновой метки, о внутримолекулярном движении. Иными словами, правильно подобранная метка может нести информацию сразу о нескольких свойствах окружения.
В нитроксильных радикалах неспаренный электрон практически полностью локализован на NO-группе радикала. Нитроксильные радикалы являются одним из немногих классов свободных радикалов, которые можно модернизировать без затрагивания свободной валентности. Возможность таких реакций определяет широкий ассортимент спиновых зондов и меток. В качестве примера можно привести реакцию спирт- радикал с хлоридами различных кислот:

В настоящее время получают распространение разнообразные нитроксильные радикалы с насыщенными углеводородными цепями любой длины. При наличии у реагирующей молекулы двух и более реакционных групп реакции без затрагивания свободной валентности приводят к соединениям радикалов между собой и с образованием бирадикалов и полирадикалов.
Практическая возможность проведения реакции без затрагивания свободной валентности определяется скоростью прохождения в реакционной смеси параллельных реакций. Из конкурентных реакций основными являются реакции с насыщенной свободной валентностью. Так, например, хлористый водород, образующийся при взаимодействии спина-радикала с хлорангидридом дикарбоновых жирных кислот способен вызывать реакцию диспропорционирования между радикалами, приводящую к образованию не парамагнитных продуктов (Розанцев Э.Г.).

Кроме реакций диспропорционирования к исчезновению парамагнетизма нитроксильных радикалов приводят и обычные реакции восстановления окисления.
Реакции восстановления радикального фрагмента достаточно эффективны, когда в среде есть не только донор электронов, но и донор протонов:
gt;N-Oo+H++|®N-OH.
Спиновые зонды являются активными акцепторами электронов. Для завершения реакции восстановления необходимы протоны. В среде, содержащей протоны, роль восстановителя могут играть любые соединения с достаточно высоким восстановительным потенциалом: муравьиная кислота, гидразин, гидрохинон, соединения с сульфгидрильными группами и др. Спиновые зонды восстанавливаются до пространственно затрудненных N-гидроксиламинов, не дающих вклад в спектр ЭПР. Восстановление спиновых зондов наблюдали уже в работах В.К.Кольтовера и соавт. (1968) и A.D.Keith, A.S.Waggoner, O.H.Griffith (1968). Скорость восстановления спинового зонда тем меньше, чем длиннее его углеводородный “хвост”. Это, по-видимому, связано с меньшей подвижностью радикалов с длинной углеводородной цепью.
Для изучения мембран применялись системы ориентирования липидов. Биологические мембраны принимают прямое или косвенное участие почти во всех биохимических процессах. Они не только образуют барьеры, характеризующиеся специфической проницаемостью, но сами участвуют в сложных химических превращениях, в частности, в митохондриальных реакциях окислительного фосфорилирования. Изучить механизм функционирования различных систем организма невозможно без знания структурно-функциональных связей на уровне мембран. Состав и морфология биологических мембран сложен и неоднороден.
Главным компонентом биологических мембран являются фосфолипиды (фосфадитилхолин, нейтральные липиды, холестерин и др.). Многочисленные данные свидетельствуют о наличии в мембранах двойных слоев (бислоев) фосфолипидов, но нельзя не учитывать присутствие широкого класса других структур. Считают, что фосфолипидный бислой является основным компонентом мембранной структуры. Поэтому проводимые в биофизике исследования с целью изучения биологических мембран были осуществлены на простых системах бислоев фосфолипидов, не осложненных влиянием большого числа других факторов мембранной структуры. Применяя зонды на основе различных веществ, были получены их ЭПР-спектры, при расшифровке которых были получены интересные данные о строении, химической структуре и биофизических свойствах мембран клеток (Sengupta S., 1972).
Среди работ, касающихся исследований биологических объектов методом спиновых зондов, большой интерес вызывают те, которые давали возможность оценки нарушения окислительно-восстановительных процессов в переживающих тканях. Так, В.П. Реутов и соавт. (1981) изучали влияние аскорбиновой кислоты, поступающей в кровь при нитритной интоксикации, на восстановление нитритных ионов. В качестве чувствительного теста на аскорбиновую кислоту использовали иминоксильные радикалы, которые при взаимодействии с ней переходят в не парамагнитное состояние в результате присоединения электронов. Измеряя скорость гибели иминоксиль- ных радикалов в плазме крови, следили за снижением содержания аскорбиновой кислоты, выделяющейся в кровь под действием различных доз NaNO2. Исследования показали, что заметное влияние на интенсификацию процесса восстановления ионов, аскорбиновая кислота оказывает лишь при введении экстремальных ее доз.
Я.Ю. Вальдман, Л.М. Вайнер, О.А. Громова, В.В. Лехвич (1981) изучали с помощью стабильных нитроксильных радикалов микросомальную цепь переноса электронов. В работе использована способность иминоксильных радикалов акцептировать электрон с определенных участков микросомаль- ной цепи переноса электронов, что тестировалось по исчезновению сигнала ЭПР. Для исследования переноса электронов с ключевого фрагмента микросомальной системы - ци
тохрома Р450 предложено использовать радикалы, обладающие субстратными свойствами по отношению к этому ферменту. Получены результаты, свидетельствующие об участии цитохрома Р450 в реакции восстановления некоторых ими- ноксильных радикалов.
В работах Л.П. Каюшина и соавт. (1971) отмечена гибель спиновых зондов в фотооблученных водных растворах сывороточного альбумина, триптофана, тирозина и цистеина, обусловленная, по-видимому, переносом электронов от фотовоз- бужденных ароматических аминокислот и цистеина на ими- ноксил. Авторы наблюдали восстановление спиновых зондов в хлоропластах и митохондриях. В случаях митохондрий восстановление ускорялось после добавления АДФ и сукцината. В митохондриальных препаратах, судя по результатам работы, (Ягужинский А.С. и соавт., 1973), иминоксильные радикалы шунтируют цепь переноса электронов.
Действия “горячих” атомов водорода, других частиц и различных видов излучения на такие биологические объекты как полимеры, тимин, ДНК, производные пиримидина и пурина, различные аминокислоты с последующим образованием в них свободных радикалов изучали R.B.Ingalls, Z.A.Wall (1961), I.Cole, W.C.Heller (1965), I.N.Herak, W.Gordy (1965, 1966), при этом были обнаружены как однотипность, так и некоторые различия действия атомов водорода и рентгеновского облучения на биологический материал. В конечном итоге было выделено 3 группы: рентгеновские лучи, ультрафиолетовые лучи, “горячие” атомы водорода, под действием которых происходит образование свободных радикалов.
Метод ЭПР широко применялся и при изучении процессов фотосинтеза. Зеленые листья подвергались лиофилизации и помещали в резонатор спектрометра. Затем были исследованы водные растворы хлоропластов. Полученные результаты дали основание предположить о наличии значительной взаимосвязи между процессом фотосинтеза и обнаруживаемыми неспаренными электронами (Commoner B., Weise I., Tawnen I., 1965; Sego P.B., Pon N.C., Calvin , 1957, 1959; Commoner B. , Heise I.I. , Zip B.B., Norbett R.E., Passonneau I.V., Townsend I., 1976).
Значительную помощь оказал метод электронного парамагнитного резонанса и при исследовании триплетных возбужденных состояний в белках (Shiga T., Mason H.S., Maso C., 1966).
Методом ЭПР был изучен гемоглобин и его производные

• состояние центрального атома железа гема и распределение их энергетических уровней, а также ряд других, важных в биологическом отношении молекул, в которых содержится железо, не входящее в состав гема (Ингрем Д., 1972).

Использование метода ЭПР с применением спиновых меток позволило создать спин-меченые биологически активные соединения, в том числе и лекарственные препараты. Это - так называемые парамагнитные модели биологически активных веществ (Жданов Р.И., 1981). Введение нитроксильного фрагмента в лекарственные вещества, нуклеотиды, белки, ко- ферменты, аминокислоты, углеводы, липиды и другие физиологически активные соединения в основном не меняют исходный тип их биологической активности, что открывает большие перспективы при использовании парамагнитных моделей в фармакологии и клинике. Некоторые из них, синтезированные на основе веществ, действующих на нервную систему, стероидных препаратов, фосфорорганических соединений, алкалоидов проходит испытание на противоопухолевую, нейротропную и другие активности. Отдельные парамагнитные модели уже находят применение в ряде методик для определения концентрации физиологически активных веществ в биологических объектах. Так, например, успешно применен спин-иммунологический метод, который позволяет определять в жидкостях организма концентрацию биологически активных веществ (Zeute R.K. и соавт., 1973; Tam I.C., 1978).