Применение метода хемилюминесценции в судебной медицине
Наряду с широким применением метода хемилюминесценции при изучении различных состояний биологических объектов, были также выполнены отдельные исследования с целью разрешения судебно-медицинских задач.
T.Isacsson, G.Wetermaru (1974) и R.Weber (1966) применили метод хемилюминесценции при исследовании крови в судебно-медицинском отношении. Авторы отметили его высокую чувствительность, экспрессность и точность.
В.Г.Баскаков (1977) в результате исследования интенсивности спектра электробиолюминесценции установлено увеличение ее в прижизненно травмированной мышечной ткани по сравнению с поврежденной посмертно, а также значительное отличие спектров прижизненно травмированных тканей в зависимости от давности травматизации по отношению ко времени наступления смерти. Динамика посмертной травмы не характеризовалась резкими отличиями спектральной картины, а была подчинена общим закономерностям посмертного изменения мышц. Автор предложил метод спектроскопии электробиолюминесценции для оценки характера травматизации мышечной ткани.
Работы Ю.Л.Мельникова (1970, 1974, 1978) посвящены изучению изменений параметров ХЛ гомогенатов печени в посмертном периоде. Опыты проведены на белых беспородных крысах-самцах массой 200-250 г. Гомогенаты ткани печени и суспензии митохондрий изготавливали по приводимой ниже методике и исследовали через определенные периоды времени (0, 3, 6, 9, 12 часов) после смерти животных. Методика: кусочки печени (2,0) промывали охлажденной до 0оС средой следующего состава: 0,25 М сахароза, фосфатный буфер 10-2 м, К2НРО4, 10-5 М раствора ЭДТА, рН 7,5. Затем кусочек помещали в охлажденный гомогенизатор и гомогенизировали до получения однородной смеси в течение 30 с в двойном объеме раствора фосфатного буфера. К 2 мл ее добавляли 0,2 мл 10-4 FeSO4, служившего катализатором и переносили в кювету. Для измерения биохемилюминесценции использовали установку, состоящую из фотоумножителя ФЭУ-42, усилителя постоянного тока, рН-метра ЛПУ-01 и самописца ПИ1-02. Измерение свечения гомогенатов проводили каждую минуту.
Интенсивность свечения рассчитывали по формуле: I - IT
Ic IT
где I - интенсивность свечения образца;
1т - темновой фон;
Ic - интенсивность свечения стандартного источника света. Полученные результаты обработаны статистически и представлены в таблице 1.
Таблица 1.
Изменение свечения гомогенатов через различные сроки после смерти животного
Время после смерти (час) |
Хемилюминесценция гомогенатов печени крыс |
|||
X’ |
х1% |
«х |
ах1% |
|
0 |
1,22 |
100 |
0,084 |
±6,8 |
3 |
0,69 |
56 |
0,024 |
±3,4 |
6 |
0,29 |
24 |
0,105 |
±3,4 |
х - среднее арифметическое интенсивности свечения, aK - среднее квадратичное отклонение.
Из таблицы следует, что интенсивность “сверхслабого свечения” общих гомогенатов печени закономерно падает в зависимости от срока посмертного периода. Через 9 и 12 часов после наступления смерти интенсивность свечения была настолько слабой, что зарегистрировать его не удалось. Всего авторам были проведены 182 исследования, из них с гомогенатами печеночной ткани - 155 и с суспензиями митохондрий - 27. Динамика биохемилюминесценции суспензий митохондрий имела общую направленность с изменением свечения общих гомогенатов печеночной ткани. Автор указал, что диагностика давности наступления смерти должна осуществляться с помощью комплекса методов исследования: гистологических, гистохимических, биохимических и биофизических (определение биохемилюминесценции).
Реакции ПОЛ в настоящее время глубоко изучены в митохондриях. Между свечением митохондрий и гомогенатов тканей установлена тесная связь. Она определяется тем, что
свечение гомогенатов обусловлено теми же процессами, которые характерны для имеющихся в них митохондриях (Владимиров Ю.А., Львова О.Ф., 1965; Львова О.Ф., 1967). Поэтому было решено исследовать сверхслабое свечение в гомогена- те мышечной ткани, простота приготовления которого наиболее приемлема для применения в экспертной практике. Помимо внутреннего состояния биологических объектов, на кинетику ХЛ и интенсивность сверхслабого свечения большое влияние оказывают различные экзогенные факторы, основными из которых являются: состав среды инкубации, концентрация кислорода, гомогената, железа, вводимого в кювету и др. Только в оптимальных условиях, когда внешние агенты не лимитируют процесс, интенсивность свечения и кинетика ХЛ будут определяться свойствами самих исследуемых тканей. Поэтому выбор условий для проведения опытов имеет большое значение. В.В.Прутовых (1978) при подборе условий для исследования гомогенатов мышц изучил влияние различных сред инкубации на параметры ХЛ. При этом оказалось, что компоненты различных сред влияют на кинетику ХЛ гомогенатов мышц так же, как и на кинетику ХЛ митохондрий. Так, использование фосфатной среды, состоящей из 20 мМ KH2PO4 и 105 мМ KCl, pH 7,4 при температуре 20-22оС приводило к быстрому завершению реакций ПОЛ, о чем судили по кинетике ХЛ. При этом все стадии ХЛ проходили за очень короткий промежуток времени, что вызывало затруднения обработки результатов. Другую картину наблюдали при исследовании гомогената в среде, состоящей из 115 мМ KCl и 10 мМ ТРИС HCl. В этом случае стадии ХЛ были довольно продолжительными и требовали значительных затрат времени для получения результата. Особенно значительно затягивался латентный период при исследовании гомогенатов травмированных тканей и составлял иногда более 50 минут. Такая продолжительность исследования пробы при наличии одной установки по регистрации сверхслабых свечений приводила к значительному разрыву во времени между исследованием контрольной и опытной пробы мышц. Разрыв во времени исследования давал значительный разброс результатов при определении давности травмы. Аналогичные данные о влиянии компонентов среды инкубации на кинетику ХЛ имеются в работах Т.Б.Сусловой (1970), Ю.А.Владимирова (1972), кото
рые исследовали влияние пиро- и ортофосфата на кинетику ХЛ митохондрий в присутствии ионов двухвалентного железа. Указанными авторами было установлено, что эти ингредиенты активируют процессы ПОЛ за счет быстрого окисления ионов железа кислородом воздуха и приводят к усилению процессов радикалобразования. Отмечено, что концентрация пиро- и ортофосфата не должна превышать 5-10 мМ, иначе возможно влияние этих веществ на кинетику медленной вспышки ХЛ. Учитывая, что параметры медленной вспышки брали в качестве основных показателей интенсивности процесса при подборе условий для исследования ХЛ гомогенатов мышц, исходили из данных рекомендаций.
отн.
I I
Рис. 8. Хемилюминограммы гомогенатов мышцы животных в различных средах инкубации при введении 10-4 М двухвалентного железа t - 2о°С, рН - 7,4;
- - среда, состоящая из 20 мМ KH2PO4 и 105 мМ KCl;
- - среда, состоящая из 10 мМ ТРИС HCl и 115 мМ KCl;
- - среда содержала 5 мМ ТРИС HCl, 5 мМ KH2PO4 и 115мМ KCl. Fe++ - момент введения железа в кювету; Т.Т. - темновой
ток ФЭУ; ШТ - момент открывания шторки ФЭУ; J - интенсивность ХЛ; t - латентный период; СС - спонтанное свечение гомогената.
Первоначальным этапом исследований, проведенных В.В.Прутовых, явился подбор среды, состоящей из 5 мМ KH2PO4;
- мМ ТрИС HCl и 115 мМ KCl при рН 7,4. В данной среде процессы протекали с умеренной скоростью, результаты были воспроизводимы и требовали немного времени для производства опытов. На рис. 8 представлены хемилюминограммы, полученные в различных средах.
Полученные результаты свидетельствуют о том, что реакции ПОЛ и кинетика ХЛ гомогенатов мышечной ткани развиваются по тем же принципам, что и в митохондриях. Поэтому в дальнейшей работе В.В.Прутовых руководствовался опытом других исследователей, занимавшихся изучением свободно-радикальных реакций в биологических объектах методом хемилюминесценции.
В ряде публикаций (Суслова Т.Б.и соавт., 1968, 1969, 1970; Владимиров Ю.А., 1969; Оленев В.И., 1976; Forthmy S. et al, 1964; Ottolenghy A., 1959; Stauff J.et al, 1964; Wills E., 1965; Barnos R. et al, 1972; Fajita T., 1972 и др) имеются данные, что металлы с переменной валентностью, в частности, ионы двухвалентного железа, при их окислении могут быть источниками свободных радикалов и инициировать реакции ПОЛ. При этом большое значение имеет концентрация железа, так как влияет на процессы ПОЛ и кинетику ХЛ. Проведенные автором эксперименты по изучению влияния различных концентраций двухвалентного железы на ХЛ гомогенатов мышц животных позволили установить, что оптимальной концентрацией является 10-4 М, при которой четко выражены все периоды в развитии ХЛ.
На кинетику ХЛ и процессы ПОЛ влияет наличие в системе кислорода. Образование радикалов, ответственных за свечение, связано также с потреблением большого его количества (Владимиров Ю.А. и соавт., 1964; Кричевская А.А. и соавт., 1976; White H., 1960; Fridovich K., 1975; Winterhalter K. et al, 1976; Steven A. et al, 1977). Эти авторы пришли к выводу, что отсутствие в системе кислорода приводит к угнетению процессов радикалообразования и ослаблению свечения. В.В.Прутовых в своей установке для подачи кислорода в систему использовал фторопластовую мешалку, приводимую в движение электромотором, обороты которой были подобраны экспериментально, исходя из требований: 1. Не должно быть при помешивании раствора пузырьков пены; 2. Мини
мальный разброс результатов при исследовании нескольких проб одного и того же гомогената. Недостаточное перемешивание раствора приводит к изменению хода реакций ПОЛ, что вызывает изменение кинетики ХЛ. Необходимость наличия мешалки обусловлена еще и тем, что при введении в исследуемую систему ионов двухвалентного железа требуется оптимальное перемешивание раствора для равномерного распределения его во всем исследуемом объеме, что также влияет на ход реакции ПОЛ и кинетику ХЛ (Шаров А.П. и соавт., 1974). Отмечено, что без перемешивания раствора наблюдается искаженная медленная вспышка ХЛ за счет диффузного растворения кислорода воздуха в исследуемой среде. В то время как в вакууме или в атмосфере инертного газа реакция ПОЛ не происходит и ХЛ не наблюдается (Львова О.Ф., 1967).
Рис. 9. Блок-схема установки для регистрации хемилюминесценции.
1- термостатируемая кювета; 2 - механическая мешалка; 3 - полиэтиленовая трубка; 4 - шторка; 5 - фотоэлектронный умножитель ФЭУ-37; 6 - источник питания ВСВ-2; 7 - усилитель постоянного тока ЛПУ-01; 8 - самописец ЭПП-09; 9 - светоизолирующий кожух; 10 - крышка установки.
Первым этапом работы В.В.Прутовых явилось исследование влияния длительности прижизненной травмы на ХЛ го- могенатов мышц экспериментальных животных. Травму наносили путем резкого раздавливания мышц бедра самцов белых беспородных крыс массой 200-250 г. специальным устройством, позволяющим определять силу воздействия динамометром К-49. При этом повреждались только мышцы, сохраняя сосуды и кости конечности. Исследования параметров ХЛ производили сразу же после нанесения травмы, а также через 0,5, 1, 3, 6, 12, 18 и 24 часа. Сразу после декапитации животного забирали травмированную и контрольную мышцы. Контролем служила мышца противоположной неповрежденной конечности того же животного. Ткани помещали в охлажденный 0,25 М раствор сахарозы (рН 7,4) и гомогенизировали в стеклянном гомогенизаторе в соотношении 1:10. Все операции по приготовлению гомогенатов проводили на холоду при 0-4оС. В качестве среды инкубации служил раствор, состоящий из 5 мМ ТРИС HCl-буфера, 5 мМ KH2PO4 и 115 мМ KCl при рН 7,4. Исследования кинетики ХЛ производили на установке для регистрации сверхслабого свечения, блок-схема которой представлена на рис. 9.
Перед началом работы все приборы прогревали в течение 30 минут. Исследования сверхслабого свечения тканей производили следующим образом. Открывают крышку установки (10) и в термостатирующую кювету помещают 2,5 мл буферного раствора и 2,0 мл гомогената ткани мышцы. Затем закрывают крышку, включают механическую мешалку (2) и начинают запись сигнала. Вначале записывают работы ФЭУ (5) в течение одной минуты, затем открывают шторку (4) и производят запись спонтанного свечения исследуемого гомогената в течение одной минуты. Через полиэтиленовую трубку, которая выведена наружу (3), в кювету вводят инициатор ПОЛ - раствор FeSO^7H2O до конечной концентрации 10-4 М и далее записывают кинетику индуцируемой ХЛ данного образца. После установления уровня стационарного свечения запись прекращают, закрывают шторку (4), выключают мешалку (2).
Кювету промывают дважды дистиллированной водой и готовят для следующего измерения. Перед началом работы установку калибруют по стандартному этанолу, в качестве ко
торого используют радиоактивное стекло ЖС-9. Для этого на дно кюветы укладывают эталон и измеряют уровень свечения, который можно регулировать, изменяя напряжение, подаваемое на ФЭУ. Детектором излучения в установке был ФЭУ- 37. Фотоумножитель чрезвычайно чувствителен к небольшим изменениям режима питания: изменение напряжения питания на 1% изменяет чувствительность фотоумножителя на ±15% (Владимиров Ю.А. и соавт., 1974). В примененной установке использовали высоковольтный стабилизатор БСВ-2, дающий 0,01% нестабильности при колебании напряжения в сети до 10%. В качестве усилителя постоянного тока использовали лабораторный рН-метр ЛИУ-01. Конечный сигнал регистрировали при помощи самописца ЭПП-09 на диаграммной ленте в виде кривой - хемилюминограммы. Для оценки результатов были взяты основные параметры ХЛ - длительность латентного периода и высота медленной вспышки или иначе интенсивность свечения. Изменения показателей, полученные в экспериментах и на экспертном материале оценивали в процентах по отношению к контролю. Полученные цифровые данные обрабатывали методом вариационной статистики.
Полученные в эксперименте типовые хемилюминограммы с различными сроками прижизненной травмы мышц представлены на рис. 10.
На хемилюминограммах видно влияние длительности прижизненной травмы на параметры ХЛ. В то же время индивидуальные различия в свечении гомогенатов контрольных мышц отдельных животных были незначительными и составляли не более 3-5%. Однако эта закономерность сохранялась для животных, которых исследовали в одной серии и находились в одинаковых условиях пребывания. На параметры ХЛ оказывало влияние также время года. Так, в летнее время отмечалось некоторое снижение интенсивности и увеличение длительности латентного периода ХЛ по сравнению с животными, исследованными зимой. Эти изменения были выражены в равной степени как в контрольных, так и в мышцах экспериментальных животных. В связи с этим соотношение оставалось всегда одним и тем же при исследовании травмированной и интактной мышц одного и того же животного. Автор решил учитывать процентное отношение показателей для конечной оценки влияния длительности посттравматического периода на параметры ХЛ, принимая параметры контрольной мышцы за 100%. Результаты опытов, проведенных в указанных интервалах времени прижизненной травмы мышц животных представлены в таблице № 2 (в каждой временной группе исследовали по 15 животных).
Таблица 2
Влияние давности прижизненной травмы на параметры ХЛ мышц животных.
Давность прижизненном травмы (час) |
Параметры ХЛ |
|
Интенсивность (J) M±m % |
Латентный период (t) M±m % |
|
К |
100 |
100 |
0 |
97,6±3,4 |
96,8±3,2 |
0,5 |
83,8±2,8 |
66,0±3,1 |
1 |
62,7±3,0 |
72,6±2,9 |
3 |
51,1±2,9 |
52,8±3,4 |
6 |
38,9±3,2 |
59,4±2,5 |
12 |
26,4±2,7 |
89,1±3,5 |
18 |
16,1±2,3 |
122,3±3,8 |
24 |
нет |
- |
По математической обработке результатов исследования установлено, что имеется статистически достоверное различие показателей между контрольными и травмированными мышцами. Наиболее убедительно на возможность определения длительности прижизненной травмы указывало изменение интенсивности свечения медленной вспышки ХЛ. Используя этот параметр можно, по мнению В.В.Прутовых, определить давность травмы в случае, если она была причинена за 30 минут до наступления смерти. Нанесение повреждения за более длительный период забоя показал еще большие различия от контроля. При этом снижение интенсивности свечения наиболее выражено в первые часы переживания травмы и через 3 часа составляет около 50% относительно контроля. При более длительных сроках переживания интенсивность свечения от 3 до 24 часов снижалась менее значительно и не сохранялась возможность определения давности повреждения в пределах времени, указанного в таблице. Динамика латентного периода имеет сложную характеристику. При давности травмы от 1 до 6 часов не было отмечено статистически достоверного различия результатов между отдельными временными промежутками при наличии его между последующими временными интервалами и между контролем. Приведенные данные свидетельствуют о том, что наиболее выраженные изменения интенсивности свечения наблюдаются в первый час прижизненной травмы. Длительность латентного периода может служить вспомогательным параметром при определении давности прижизненной травмы от 1 до 6 часов. Однако при травмах с большей продолжительностью переживания (более 6 часов), когда изменение интенсивности свечения незначительно, наиболее ценным показателем является длительность латентного периода. Таким образом, целесообразно при определении давности травмы до одного часа проводить учет обоих параметров ХЛ. В период от 1 до 6 часов основным показателем является интенсивность свечения при ориентирующих значениях латентного периода и при травмах длительностью более 6 часов основным параметром является изменение длительности латентного периода с учетом интенсивности ХЛ.
На рис. 11 показано влияние давности прижизненной травмы на параметры контрольных и травмированных мышц экспериментальных животных.
TJ%
140 120 100 №
60 40 30
0 1 3 * 13 IK 3' fl*C
Рис. 11. Динамика параметров ХЛ гомогенатов мышц в зависимости от сроков прижизненной травмы.
1 - параметры контрольных мышц; 2 - длительность латентного периода травмированных мышц; 3 - интенсивность травмированных мышц; J - интенсивность свечения; t - давность прижизненной травмы.
Из рисунка видно, что параметры ХЛ контрольных (интакт- ных) мышц постоянны и не зависят от длительности посттравматического периода. В травмированных тканях наиболее однозначно изменяется интенсивность свечения медленной вспышки, уменьшаясь вплоть до 24 часа посттравматического периода. Динамика изменения латентного периода имеет тенденцию к снижению при травме до трех часов с небольшим увеличением в интервале 1-2 часа с последующим увеличением его длительности до 24-х часов. Уменьшение интенсивности свечения гомогенатов травмированных мышц, по-видимому, связано с угнетением процессов ПОЛ в них, что приводит к уменьшению интенсивности свечения. Возможно это связано с потерей жизнеспособности тканей и снижением интенсивности общего уровня реакций ПОЛ за счет выделения каких-либо веществ, влияющих на ход этих реакций. Изменение латентного периода также свидетельствует о том, что в травмированной мышце происходят процессы, влияющие на ПОЛ. Причем волнообразное изменение этого параметра наводит на мысль, что к моменту исследования в травмированной мышце содержатся вещества, по-разному влияю
щие на параметры ХЛ. В первые 6 часов посттравматического периода преобладают вещества, уменьшающие длительность латентного периода, а в последующем, наоборот, - удлиняющие его. На основании изложенного автор пришел к выводу, что использование метода регистрации ХЛ позволяет с достаточной степенью достоверности решать вопрос о длительности прижизненной травмы скелетной мускулатуры путем сопоставления параметров ХЛ травмированных мышц с контролем в интервале от 30 минут до 24 часов. Кроме того, результаты проведенного исследования дают возможность использовать метод ХЛ для дифференциальной диагностики давности травмы при решении вопроса о последовательности нанесения повреждений, сопоставляя показатели травмированных мышц между собой.
Таблица 3
Влияние посмертного периода на параметры
хемилюминесценции гомогенатов мышц с различными сроками прижизненной и посмертной травмы.
Время после смерти (час) |
Давность прижизненной и посмертной травмы |
Параметры ХЛ |
|
Интенсивность M±m % |
Латентный период M±m % |
||
0 |
К 30 мин. до смерти 1 час до смерти 10 мин. после смерти |
100 83,8±2,8 62,7±3,0 96,2±2,1 |
100 66,0±2,4 72,6±2,8 107,6±2,3 |
12 |
К 30 мин. до смерти 1 час до смерти 10 мин. после смерти |
86,4±2,7 43,7±1,9 17,2±2,1 75,0±2,3 |
117,3±2,9 79,6±2,1 105,7±3,0 128,4±2,6 |
24 |
К 30 мин. до смерти 1 час до смерти 10 мин. после смерти |
69,6±2,2 12,3±1,8 нет 58,3±2,6 |
147,5±3,5 115,2±3,8 156,8±3,6 |
Примечание. В каждой группе исследовалось по 6 животных.
В.В.Прутовых изучал также влияние посмертного периода на кинетику хемилюминесценции. Он проводил серию опытов, в которых исследовали влияние посмертного периода на параметры ХЛ гомогенатов контрольных и травмированных мышц животных. Травму животным наносили аналогичным способом за 30 минут и 1 час до наступления смерти, а также через 10 минут после нее. Трупы хранили при температуре 22-28оС и относительной влажности 80-90% в комнатных условиях. Исследования проводили сразу после забоя животных, а также через 12 и 24 часа после наступления смерти по описанной методике.
Результаты исследования влияния посмертного периода на параметры ХЛ представлены в таблице 3.
Установлено, что в посмертном периоде параметры ХЛ гомогенатов мышц изменяются как в травмированных, так и в интактных мышцах животных. При этом интенсивность ХЛ снижается по мере увеличения длительности посмертного периода гораздо быстрее в травмированных, чем в контрольных мышцах, с сохранением различий в зависимости от давности прижизненной травмы (рис. 12).
ш
Рис. 12. Влияние посмертного периода на интенсивность ХЛ мышц с различными сроками травмы.
1 - контроль; 2 - прижизненно травмированная мышца за 30 минут до смерти; 3 - за 1 час до смерти; 4 - через 10 минут после наступления смерти; J - интенсивность ХЛ; t - посмертный период.
На рисунке видно, что при травме, нанесенной за один час до наступления смерти свечение в гомогенате не наблюдается через одни сутки посмертного периода. При давности прижизненной травмы 30 минут свечение наблюдалось с сохранением достоверного различия между травмированными за один час до смерти, контрольными и травмированными посмертно мышцами. Длительность латентного периода во всех случаях увеличивалась аналогично изменению интенсивности ХЛ (рис.13).
Рисунок 13. Влияние посмертного периода на длительность латентного периода ХЛ мышц с различными сроками травмы.
1 - контроль; 2 - прижизненно травмированная мышца за 30 минут до смерти; 3 - за один час до смерти; 4 - через 10 минут после наступления смерти; t - длительность латентного периода; t - посмертный период.
Полученные результаты свидетельствуют о том, что, несмотря на влияние посмертного периода, достоверные различия параметров ХЛ мышц, обнаруженные между травмированными в различные сроки и контрольными, сохраняются. Это по мнению В.В.Прутовых, дает возможность использовать метод ХЛ для дифференциальной диагностики прижизненности (посмертности) и давности травмы скелетных мышц с обязательным исследованием неповрежденных мышц того же животного.
Автор провел также исследование экспертного материала методом регистрации хемилюминесценции. Однако, вследствие различного содержания и структуры липидов и ненасыщенных жирных кислот в тканях человека и животных процессы ПОЛ протекают неодинаково, что отражается на кинетике ХЛ. Несмотря на неоднородность липидного состава тканей различных животных и человека, имеются значительные различия в количестве отдельных липидов (Deshen Z. et al, 1963; Pallet P. et al, 1973). Выполненные эксперименты позволили подобрать оптимальные условия, при которых наблюдалась ХЛ в гомогенатах мышц человека, для чего автору пришлось в значительной мере изменять методику исследования. Охлаждение ФЭУ производили проточной дистиллированной водой, что обеспечивало достаточно стабильный режим работы установки. В качестве среды инкубации применена активная фосфатная среда, состоящая из 30 мМ KH2PO4 и 95 мМ KCl при pH 7,4. Конечная концентрация двухвалентного железа в кювете составляла 10-3 М. Проводили УФ- облучение гомогената мышц человека полным спектром лампы ПРК-4 в течение трех минут.
Объектами исследования были травмированные мышцы людей, погибших на месте происшествия (20 случаев) и проживших после травмы в пределах одного часа (12 случаев), а также материал, взятый при производстве оперативных вмешательств по поводу различных травматических повреждений (6 случаев). Параметры ХЛ гомогенатов мышц исследовали на протяжении одних суток посмертного периода. Наряду с прижизненной травмой исследовали мышцы, травмированные через 3 часа после наступления смерти. Для исключения случайных влияний на результаты опытов исследование каждого гомогената мышцы производили дважды. Регистрацию параметров ХЛ мышц трупов производили через
- 6, 12 и 24 часа после наступления смерти. Кроме того, исследовали мышцы трупов с такими же сроками травмы, поступившие в морг в более поздние сроки от момента смерти (32 случая, лица, погибшие от тупой травмы, в возрасте 3-70 лет). Полученные результаты представлены в таблице 4 и на графике изменений интенсивности ХЛ (рис. 14).
Конечный результат дан в процентах по отношению к ин- тактной мышце, так как у различных трупов наблюдались ин
дивидуальные колебания параметров ХЛ. Соотношения результатов в зависимости от давности травмы и посмертного периода всегда однообразно изменялись в травмированной и контрольной мышцах различных трупов.
Было установлено, что кинетика ХЛ гомогенатов мышц человека несколько отличается от таковой у экспериментальных животных. Интенсивность ХЛ нарастает постепенно и значительно больше, чем в гомогенатах мышц животных. На рис. 15 представлены типовые хемилюминограммы гомогенатов контрольных и травмированных мышц человека.
Результаты исследования экспертного материала с различными сроками прижизненной и посмертной травмы представлены в таблице 4.
Таблица 4
Влияние прижизненности и давности травмы на параметры ХЛ мышц человека в посмертном периоде.
Г руппа исслед. мышц |
Количество исследуемых трупов |
Время после смерти |
Параметры ХЛ в % к контр олю |
|
Интенсив ность |
Латен тный период |
|||
M±m |
M+m |
|||
|
7 |
3 |
69,5+4,7 |
125,9+3,4 |
Травма |
14 |
6 |
43,5+2,4 |
139,3+3,3 |
перед |
11 |
12 |
28,5+3,0 |
152,2+4,2 |
смертью |
14 |
24 |
нет |
- |
Травма в |
5 |
3 |
43,9+5,4 |
140,6+6,8 |
пределах 1 |
8 |
6 |
20,0+2,2 |
163,7+4,4 |
часа до |
7 |
12 |
нет |
- |
смерти. |
6 |
24 |
нет |
- |
|
12 |
3 |
100 |
100 |
Контроль |
12 |
6 |
103,5+3,7 |
102,4+4,8 |
* а н т « а т н я |
12 |
12 |
98,7+4,2 |
110,2+4,2 |
мышца) |
12 |
24 |
99,4+7,2 |
107,3+5,4 |
|
12 |
3 |
103,2+3,0 |
97,4+3,4 |
Посмертн. |
12 |
6 |
107,3+3,1 |
103,0+3,6 |
травма |
12 |
12 |
102,5+2,2 |
103,5+2,6 |
|
12 |
24 |
106,0+3,2 |
114,5+3,5 |
Примечание. Параметры ХЛ контрольных и травмированных посмертно мышц даны для 12 случаев, исследованных через 3, 6, 12 и 24 часа посмертного периода.
Динамика интенсивности ХЛ гомогенатов травмированных и интактных мышц трупов людей представлена на рисунке 16.
Wamp;/. оо
Из данной таблицы и графика следует, что в интактных и травмированных посмертно мышцах изменения в первые сутки посмертного периода выражены незначительно, различия между ними статистически не достоверны. Изменения параметров ХЛ в прижизненно травмированных мышцах зависят от длительности посттравматического периода. Так, в случае давности травмы в пределах 1 часа к 12 часам посмертного периода свечение в гомогенатах отсутствует, в то время как при травме, нанесенной непосредственно перед смертью исчезновение свечения отмечается только к 24 часам. Аналогичные изменения наблюдали и в отношении латентного периода, длительность которого увеличивается пропорционально давности травмы и времени, прошедшему от момента смерти.
лт Ш
Рис. 16. Хемилюминограммы (ХЛГ) интактной мышцы и при добавлении различных гомогенатов.
1 - ХЛГ интактной мышцы; 2 - ХЛГ при добавлении 0,5 мл аналогичного гомогената; 3 - ХЛГ при добавлении 0,5 мл гомогената травмированной мышцы; остальные обозначения как на рисунке 3.
Исследование клинического материала показало, что через 12 часов посттравматического периода в гомогенатах травмированных мышц сверхслабое свечение не обнаруживалось и хемилюминограммы имели вид прямой линии. Всего было исследовано 6 прижизненно травмированных мышц в интер-
вале от 12 до 24 часов, проведено 20 исследований, и ни в одном случае не было получено результатов, свидетельствующих о наличии сверхлабого свечения. В нескольких случаях, когда потерпевшие находились в стационаре в течение нескольких часов перед смертью, соотношения параметров ХЛ контрольных и травмированных мышц значительно различались и были весьма вариабельными. Это обусловлено, по-видимому, влиянием на параметры ХЛ различных медикаментозных препаратов, вводимых больным в период их лечения (Шаров А.П., 1974; Кричевс- кий А.А. и соавт., 1976; Арчаков А.И., 1971). Травма приводит к нарушению кровоснабжения в месте ее причинения и, по-видимому, концентрация вводимых в организм веществ будет различной в интактной и травмированной мышцах, что, вероятно, и дает разброс полученных результатов.
При исследовании экспертного материала у В.В.Пруто- вых возникли определенные трудности, выражающиеся в том, что в судебно-медицинской практике из-за обширности места травматизации не всегда была возможность использовать в качестве контроля неповрежденную мышцу противоположной конечности или симметричного участка тела. Подобные случаи часто встречались при экспертизе транспортной травмы и падения с высоты. В связи с этим, для установления возможности использования в качестве контроля не только однородных, а также и других мышц, были исследованы параметры ХЛ сгибателей и разгибателей бедра и плеча, мышцы ягодичной области и грудные мышцы.
Результаты исследования показали, что интенсивность, длительность латентного периода, а также кинетика ХЛ гомогенатов различных групп скелетной мускулатуры практически не отличались между собой. Следовательно, в качестве контрольных образцов можно использовать практически любую поперечно-полосатую скелетную мышцу.
Своеобразное изменение параметров ХЛ, выражающееся в снижении интенсивности свечения и увеличения длительности латентного периода, позволяет предположить, что в прижизненно травмированной мышце происходят процессы активации или образования веществ, угнетающих ПОЛ и приводящих к изменению кинетики ХЛ. Для разрешения этого вопроса автор провел серию опытов, в которых гомогенат травмированной мышцы добавлял к гомогенату интактной и производил иссле
дование кинетики ХЛ. С этой целью 0,5 мл гомогената травмированной мышцы, в которой не отмечалось свечение, прибавлял в кювету, где находился гомогенат интактной мышцы и по принятой методике производил регистрацию параметров ХЛ. В качестве контроля исследовали влияние добавления такого же количества гомогената интактной мышцы. Во всех случаях добавления гомогената травмированной м
Источник: Пашинян Г.А., Назаров Г.Н., «Биофизические методы исследования в судебной медицине» 1999
А так же в разделе « Применение метода хемилюминесценции в судебной медицине »
- Глава 1. МЕТОД ЭЛЕКТРОННОГО ПАРАМАГНИТНОГО РЕЗОНАНСА.
- Элементы теории ЭПР
- Общие сведения о ЭПР-спектроскопии
- Применение метода ЭПР в биологии
- Применение метода ЭПР в медицине
- Применение метода ЭПР в судебной медицине
- Применение метода ЭПР при установлении ДНС
- Применение метода ЭПР при установлении прижизненное и давности причинения телесных повреждений
- 1.6. Подготовка образцов и исследование методом ЭПР
- Глава 2. МЕТОД ХЕМИЛЮМИНЕСЦЕНЦИИ
- Теоретические основы метода хемилюминесценции
- Интенсивность хемилюминесценции в зависимости от некоторых состояний организма
- Глава 3. МЕТОД ИЗМЕРЕНИЯ ЭЛЕКТРОПРОВОДНОСТИ.
- Метод определения комплексной относительной диэлектрической проницаемости и проводимости в диапазоне сверхвысоких частот.