Доказательством клональной основы иммунного ответа послужило создание гибридомной технологии для получения моноклональных антител. Технология основана на двух достижениях клеточной биологии:

• разработке метода гибридизации соматических клеток (первоначально его использовали преимущественно в генетике);
• получении линий миеломных клеток.

В 1976 г. Г. Келер (G. Koehler) и Ц. Мильштейн (C. Milstein) применили соматическую гибридизацию для слияния миеломных и нормальных антителообразующих клеток, что привело к созданию качественно новой клеточной технологии гибридом (рис. 3.122), революционизировавшей как иммунологию, так и биотехнологию.
Несколько ранее Ц. Мильштейн впервые использовал миеломные белки как источник гомогенных иммуноглобулинов, необходимых для изучения структуры V-доменов антител. Иногда удавалось определить специфичность этих моноклональных иммуноглобулинов, но большой проблемой была невозможность получения моноклональных антител заданной специфичности. В данном чисто исследовательском контексте и решалась задача получения гибридом — клеток, совмещающих два свойства: способность к неограниченному росту, которую они наследуют от миеломных (опухолевых) клеток, и задаваемую иммунизацией специфичность, которую они получают от антителообразующих клеток, присутствующих в селезенке иммунизированных мышей.
Первоначально для слияния клетки обрабатывали вирусом Сендай. Позже с этой целью стали применять полиэтиленгликоль, вызывающий слияние клеточных мембран, благодаря наличию в его составе, наряду с гидрофильными, гидрофобных групп. Для создания гибридом, продуциру-

Рис. 3.122. Схема получения гибридом
ющих чистые моноклональные антитела, были получены мутанты миеломы, не секретирующие иммуноглобулины. Практически все линии миелом, используемые в настоящее время для гибридизации, происходят от культивируемого варианта Р3 миеломы MOPC-2, развившейся у мышей линии BALB/c и продуцирующей IgG к-типа. При получении гибридом чаще других применяют сублинии P3 X63-Ag8.653, NS-Ag4/1 и Sp2/0-Ag14 (последняя сама по себе гибридома — продукт слияния клеток линии P3 X63-Ag8.653 и нормальных спленоцитов мышей линии BALB/c).
Клетки этих линий, утратившие способность секретировать собственные иммуноглобулины, были отобраны на селективных средах на устойчивость к 8-азагуанину и 6-тиогуанину (что отражено в их обозначениях). У этих клеток блокирован запасной путь синтеза нуклеотидов из гипоксантина и гуанина, используемых в качестве предшественников нуклеотидов. Эти особенности используют для отбора гибридных клеток после слияния. При соблюдении всех деталей технологии доля слившихся клеток с нужными характеристиками (возникших при слиянии клетки миеломы и антителообразующей клетки) невелика, поэтому необходимо создавать особые условия для их селекции. Нормальные партнеры для слияния способны выживать in vitro в течение нескольких дней и затем погибают. Для подавления роста опухолевых партнеров используют селективную среду НАТ, содержащую гипоксантин (Н — Hypoxantine), аминоптерин (А — Aminopterine) и тимидин (T — Thymidine). Аминоптерин — яд, подавляющий основной путь биосинтеза нуклеотидов, гипоксантин и тимидин — субстраты для реализации запасных путей, заблокированных у миеломных клеток (о чем свидетельствует устойчивость к 8-азагуанину и 6-тиогуанину), но реализуемых у гибридных клеток, которые наследуют соответствующий ген от нормальной
родительской клетки. В результате культивирования на среде НАТ выживают только гибриды нормальных и опухолевых клеток, унаследовавшие от клеток миеломы «бессмертие», а от нормальных клеток — способность синтезировать нуклеотиды из гипоксантина и тимидина. Неслившиеся опухолевые клетки или гибриды типа «миеломахмиелома» погибают, поскольку в среде HAT нет субстрата для синтеза ими нуклеотидов или этот процесс заблокирован. Неслившиеся нормальные клетки или их гибриды друг с другом погибают, поскольку не способны длительное время выживать in vitro. Выжившие клетки переводят сначала на среду НТ, а затем на обычную ростовую среду RPMI 1640. Затем возникает необходимость в отборе клеток-продуцентов антител нужной специфичности. Это необходимо сделать как можно раньше, чтобы нужный клон не был подавлен другими клетками. Антитела к растворимым антигенам выявляют в иммуноферментной тест-системе, а к мембранным — методом проточной цитометрии. При выявлении продуцентов антител нужной специфичности их клонируют — проводят несколько пассажей клеток, постепенно увеличивая их разведение вплоть до одной клетки на лунку. Для каждого пассажа берут клетки из лунок с наибольшим титром антител. Получив несколько клонов, поддерживают те из них, которые обладают преимуществами перед другими по специфичности антител, продуктивности, скорости роста и изотипу (предпочтитение отдают IgG-антителам). Моноклональность подтверждают методом изоэлектрофокусирования, доказательством гомогенности по изотипу и т.д. Обычно на этапах отбора и повторного клонирования теряется много клонов. Отобранные и стабилизированные путем повторных клонирований гибридомы хранят в замороженном состоянии в жидком азоте. Для наработки моноклональных антител клетки гибридомы культивируют in vitro или in vivo в брюшной полости сингенных мышей линии BALB/c или их гибридов с другими линиями.
Несмотря на значительные целенаправленные усилия, не удалось разработать адекватные методы получения гибридом на основе клеток человека, хотя потребность в человеческих моноклональных антителах, которые можно было бы использовать при иммунотерапии, очень велика. В настоящее время эту проблему решают с помощью генно-инженерных подходов. Самый распространенный среди них — «гуманизация» мышиных антител. Метод состоит в создании генетических комплексов, объединяющих V-гены мышиных антител и С-гены иммуноглобулинов человека. Следующим шагом послужила замена не только С-генов, но и каркасных последовательностей F-генов мыши соответствующими последовательностями генов человека. В этом случае от мышиных антител остаются только гипервариабельные участки, определяющие специфичность антител, но не их антигенность.
В настоящее время получение моноклональных антител стало одним из наиболее доходных направлений биотехнологического бизнеса. Получено огромное число моноклональных антител, с помощью которых решены многие принципиальные проблемы иммунологии и других разделов биологии. Моноклональные антитела широко используют в иммунодиагностике. Проточная цитометрия была усовершенствована и нашла чрезвычайно широкое распространение в значительной степени благодаря применению моноклональных антител. Их используют также для фракционирования клеток, чрезвычайно востребованного в экспериментальных исследованиях, а в последние годы ставшего очень актуальным в связи с быстрым развитием цитотерапии. Наконец, моноклональные антитела используют в иммунотерапии как самостоятельные факторы и основу для создания иммунотоксинов.
Гибридомы получают также путем слияния клеток иной природы, чем антителопродуценты, например Т-лимфоцитов. Однако этот прием используют исключительно в экспериментальной иммунологии.
Генно-инженерные антитела
Часто возникает необходимость получить (с различными целями) искусственный белок, воспроизводящий минимальную часть молекулы антитела, содержащую ее антигенсвязывающий участок. Такая молекула должна содержать V-домены Н- и L-цепей. С точки зрения генной инженерии получение такой конструкции не представляет особого труда. Однако для решения задачи отбора антителоподобных молекул требуемой специфичности потребовалось разработать специальную технологию фагового дисплея.
Для создания библиотек фагового дисплея V-гены Н- и L-цепей, выделенные из библиотек экспрессируемых генов В-лимфоцитов, комбинируют в случайных сочетаниях. В результате получают огромный набор Fab-молекул разнообразных специфичностей — комбинаторную библиотеку. Гены этих молекул сливают с генами филаментозного белка оболочки бактериофага pIII. Такие фаги размножают в бактериях, которые продуцируют частицы фага, несущие продукты слитых генов. Комплекс таких фагов и составляет библиотеку фагового дисплея. При необходимости связывая с фиксированным антигеном, из популяции извлекают фаги, кодирующие Fab-домены нужной специфичности. Таким фагом можно инфицировать бактериальные клетки, которые будут служить источником данных антигенспецифических молекул.
В качестве минимальной антигенсвязывающей молекулы используют scFv (Single chain fragment variable). Они представляют собой единую молекулу, содержащую связанные ковалентно V-домены Н- и L-цепей. Такие молекулы могут быть димеризованы. Другой вариант молекул антител, сконструированных методами генной инженерии — мини-тела (Minibody). Они представляют единую полипептидную цепь (молекулярная масса около 60 кДа), содержащую два p-слоя из ^-домена по 3 р-складки в каждом. В этих слоях содержатся гипервариабельные петли H1 и H2. При их создании и селекции также используют методы фагового дисплея.
Подобные минимальные антигенсвязывающие белки дают значительные преимущества при создании более сложных молекулярных конструкций (конъюгатов с маркерными молекулами, ферментами, флуорохромами), используемых в настоящее время как в исследовательских, так и в диагностических целях), а также для доставки лекарственных средств и токсинов в целях иммунотерапии. Гены мини-тел формируют не только из нативных генов, но и комбинируя их гипервариабельные участки (CDR).