Определение противотуберкулезных антител для диагностики туберкулеза было начато еще в 20-е гг. XX века (лейкагглютинаци, лейкоцитолиз, пассивная гемагглютинация). С конца 70-х гг. развиваются методы иммуно-ферментного анализа (ИФА), широко распространенные в клинической практике (например, для диагностики вирусных гепатитов или ВИЧ-инфекции). В диагностике туберкулеза серологические методы, в том

числе ИФА, не оправдали всех возлагавшихся надежд, поскольку не удалось обнаружить специфичных антигенов М. tuberculosis, на которые у большинства больных вырабатываются соответствующие антитела. Существующие иммуноферментные тест-системы обладают специфичностью на уровне 90-94% (6-10% ложноположительных результатов у здоровых лиц или больных нетуберкулезными заболеваниями), тогда как чувствительность (число положительных результатов у больных активным туберкулезом) составляет, в среднем, около 70%. Поэтому говорить о самостоятельном значении данного метода для дифференциальной диагностики туберкулеза органов дыхания пока не представляется возможным. Предложенные в последние годы для определения противотуберкулезных антител иммунохроматографические тесты хотя и отличаются простотой и быстротой выполнения, но обладают теми же недостатками, что и традиционный ИФА.
Для определения антигенов М. tuberculosis используются аффинно очищенные антисыворотки против микобактерий. Для определения антигенов в сыворотке крови необходимо диссоциировать иммунные комплексы, но в плевральной и в спинномозговой жидкости антигены можно определять методом непрямого твердофазового иммуноферментного анализа. Главной проблемой является получение антител, обеспечивающих достаточную специфичность и чувствительность исследования, особенно при непосредственном использовании клинического диагностического материала.
Молекулярно-генетические методы обнаружения М.tuberculosis основаны на полимеразной цепной реакции (ПЦР). Принцип метода состоит в циклическом повторении трех стадий реакции:
  1. денатурации ДНК при нагревании;
  2. гибридизации искусственно синтезированных олигонуклеотидов с фланговыми участками цепей амплифицируемого фрагмента ДНК (так называемых «праймеров» или «затравочных» фрагментов);
  3. синтеза (достройки) цепи фрагмента ДНК с помощью термостабильной ДНК-полимеразы. Многократное удвоение цепей ДНК (30-40 циклов) позволяет в течение нескольких часов умножить (амплифицировать) специфический участок ДНК в геометрической прогрессии, а затем идентифицировать его (при электрофорезе в агарозном геле в присутствии красителя этидия бромида синтезированный фрагмент ДНК выявляется в виде светящейся под действием ультрафиолета полосы).

Высокая чувствительность (теоретически возможно определять единичные M.tuberculosis в образце) и быстрота проведения анализа (1-2 дня) чрезвычайно ценны для клинической практики. Метод эффективен в отношении возбудителей с высокой антигенной изменчивостью (в том числе L-форм), определение которых требует длительного культивирования и сложных
М

питательных сред. Однако метод не позволяет определять степень жизнеспособности выявляемых микобактерий.
Метод ПЦР перспективен для дифференциации М. tuberculosis и нетуберкулезных микобактерий (в том числе и после культивирования микобактерий, особенно на жидких питательных средах с использованием систем типа ВАСТЕС) и для быстрого определения лекарственной устойчивости. Штаммовая идентификация М.tuberculosis позволяет определять внутривидовые различия возбудителя туберкулеза и представляет интерес для эпидемиологических исследований и определения роли суперинфекции при рецидивах туберкулеза.
Проблема специфичности ПЦР в диагностике туберкулеза обусловлена высоким риском ложноположительных результатов, поскольку продукты амплификации (фрагменты ДНК) легко могут попасть в исследуемые образцы и служить матрицей для новых реакций. Это определяет очень жесткие требования к технологии проведения анализов, в том числе - раздельные помещения для каждой из трех стадий анализа. Проблема может быть решена за счет инактивации загрязняющих молекул специальными реагентами и совершенствования технологии подготовки клинических образцов (выделение ДНК на микропористых частицах стекла, иммуномагнитная сепарации микобактерий и проч.).
Использование методов, основанных на амплификации фрагментов генома микобактерий (ПЦР), допускается в России как дополнительный метод ускоренной дифференциальной диагностики туберкулеза при обязательном параллельном применении классических микробиологических методов [3, 5].
Молекулярно-генетические исследования могут проводиться в лабораториях краевых, областных и крупных городских противотуберкулезных учреждений, использующих утвержденные Минздравом России наборы реагентов (тест-системы) и имеющих лицензию на работу с микроорганизмами III-IV групп патогенности [7]. Технология проведения ПЦР приводится в описаниях и инструкциях по применению соответствующих наборов (тестсистем).