Биологические методы. В течение многих лет единственными методами оценки уровня того или иного гормона были биологические. В основе последних лежит единый принцип: в системе in vivo или in vitro (тот или иной вид животных, клеточная культура, ферментная система) тестируют эффекты определенных количеств изучаемого гормона и на этой основе строят стандартную кривую. Затем на той же тест-системе сравнивают уровень биологической активности исследуемой пробы с соответствующим отрезком стандартной кривой. На этом принципе, например, основан метод определения биологически активного лютеинизирующего гормона (ЛГ), где суспензия клеток Лейдига мышей инкубируется с международным стандартом ЛГ и образцами исследуемой сыворотки крови. По количеству синтезируемого тестостерона, который определяется радиоиммунологическим (РИА) методом, судят об уровне активности ЛГ в исследуемых образцах биологического материала. Метод обладает очень высокой чувствительностью и точностью и может быть использован для любых видов животных и человека. В некоторых случаях уровень иммунореактивного ЛГ не коррелирует с уровнем био-ЛГ. На таком же принципе основан метод определения биологически активного ФСГ. Биологические методы незаменимы при скрининге гормональной активности вновь синтезируемых соединений. Например, андрогенную активность синтезируемых стероидов тестируют на неполовозрелых или кастрированных крысах. Рост предстательной железы в этом случае строго зависит от дозы тестостерона (Т), поэтому активность неизвестного стероида сравнивают с активностью эндогенного гормона. Биологические методы также широко используются для скрининга синтезируемых стерои- лов эстрогенного ряда или для определения специфических антител, стимулирующих щитовидную железу.
Биологические методы сохраняют свое значение не только в научных исследованиях, но и в диагностической эндокринологической практике. Особенно это касается белковых и пептидных гормонов.
Химические методы сыграли определяющую роль в раскрытии структуры стероидных и гиреоидных гормонов. Были выделены и идентифицированы все основные эндогенные стероиды и их метаболиты. Использование инструментальных методов, таких как инфракрасная спектрография, аминокислотный анализатор, масс-спектрография и позже ЯМР и др., обеспечило качественно новый уровень в изучении биохимии пептидных и стероидных гормонов. В биохимической эндокринологии широко использовались и продолжают применяться все разновидности хроматографий: бумажная, колоночная с разными сорбентами, тонкослойная, газовая и в последнее время — жидкостная, высокоразрешающая под высоким давлением. Эти методы позволили получить важные сведения об аминокислотной последовательности пептидов, белков, раскрыть их структуру, а также химическую структуру гипоталамических нейропептидов, ПГ и многих других биологически активных соединений.
Использование химических методов в биохимии стероидов, в частности метода Портера — Зильбера для определения 17-оксикортикостероидов t l7-OKC) и реакции Циммермана для определения 17-кетостероидов (17-КС), сыграло важную роль в диагностике гормональной дисфункции коры надпочечников. До настоящего времени химические методы рутинно используются для определения метаболитов катехоламинов, например ванилил- чиндальной кислоты (ВМК), важного маркера феохромоцитомы. Нельзя забывать также о важной роли гистохимических, иммуногистохимических и электронно-микроскопических методов. Широкое использование методов молекулярной биологии позволяет изучать механизм действия гормонов, а метод рекомбинантной ДНК наряду с этим обеспечил прорыв в синтезе белковых и гликопротеидных гормонов.
Современные методы гормонального иммуноанализа. В настоящее время радиоиммунологические и родственные им неизотопные методы иммуноанализа образуют в совокупности единую биотехнологическую систему, позволяющую определить любые биологически активные соединения в диапазоне концентраций от 10'6 до 10'12 М и ниже. В отличие от классических химических методов, эти методы обладают высокой чувствительностью, специфичностью и необычайно высокой производительностью, что очень важно в диагностическом мониторинге и выполнении скрининговых программ. Они являются неотъемлемой частью клинической биохимии.
Радиоиммунологический метод (РИА). В 1960 г. Ялоу и Берсон (США) впервые описали метод определения инсулина, основанный на принципе радиоиммуноанализа, а Икинс (Англия) опубликовал метод определения тироксина с помощью сатурационного анализа. В первом случае в качестве связывающего компонента были использованы антитела к инсулину, во зтором — использовался специфический транспортный белок к тироксину. В качестве меченого компонента в обоих методах применялся радиоактивный йод. Основной принцип иммуноанализа — реакция антитела (Ат) и антигена (Аг). При взаимодействии антитела и антигена образуется комплекс антитело — антиген (Ат/Аг). В определенных условиях (время, температура) эта реакция приходит в равновесие, т.е. Ат+Аг Ат/Аг. Далее различными способами разделяют связанный и свободный гормоны. В результате конкуренции между радиоактивным и немеченым гормоном зк связывающие участки отношение связанного с Ат меченого и немеченое* гормона уменьшается пропорционально концентрации последнего, т.е. ов- ределяемого гормона. Строится стандартная кривая, содержащая известные количества немеченого гормона. По этой кривой легко рассчитать содержание гормона в исследуемой пробе биологического материала.
В классическом первоначальном варианте РИА строго определенное (ограниченное) количество антител взаимодействует с гормоном, присутствующим в различных концентрациях. В этом случае в качестве меченого компонента реакции используется гормон. В дальнейшем большое развитие и широкое использование получил иммунометрический вариант РИА (та*: называемый IRMA), в котором используются меченые антитела. Это позволило значительно увеличить чувствительность метода. Принцип иммуноанализа применим как для крупных белковых молекул, так и для низкомолекулярных соединений, таких как стероиды, простагландины, гормоны щитовидной железы и т.д.
Наряду с вышеназванными достоинствами радиоиммунологические методы имеют много недостатков, к которым в первую очередь относится использование радиоактивного материала (тритий и *2;Ч). Хотя для персонала лаборатории радиоактивность не представляет опасности, тем не менее для предприятий радиохимической промышленности, где производят эти компоненты, — это реальная опасность для здоровья. Кроме того, короткий период полураспада 1251 ограничивает время использования РИА- наборов.
Параллельно с использованием РИА-методов шли поиски альтернативных неизотопных методов определения гормонов.
Неизотопные методы. Оптимальными методами иммуноанализа являются фотоэмиссионные или люминесцентные методы, в которых детекция метки проводится по регистрации излучения света. Существует несколькс типов люминесценции, которые различаются только источником энергии воздействия на вещество. К ним относятся радиолюминесценция, хемилю- минесценция и фотолюминесценция. Достижения белковой химии обеспе чили быстрое развитие иммуноферментных (ИФА) методов.
Иммуноферментный метод. В ИФА-методах в качестве меченого ком понента чаще всего используют два фермента — пероксидазу хрена ил] щелочную фосфатазу. В настоящее время при ИФА применяют твердофаз ные носители (пробирки и планшеты), которые покрываются антителамр В таком варианте этот подход получил название твердофазного иммунофер ментного метода (ELISA). Созданию и широкому использованию ELIS способствовало получение больших количеств моноклональных антите. Метод обеспечивает определение гормонов в пикограммовых количествах сопоставим по чувствительности с IRMA.
Флюоресцентный иммуноанализ. Существует несколько разновидности данного метода. Он может быть основан на принципе усиления, rauieHj или поляризации флюоресценции, а также на основе регистрации флюор сцениии с разрешением во времени. Последний вариант известен как си тема “Дельфия”. В качестве меченого компонента используется редко:- мельный элемент европий. “Дельфия” является не только надежным мет дом определения гормонов, но и технологией выбора при проведении скр нинга на врожденный гипотиреоз.
Метод усиленной люминесценции. В последние годы широкую популярность получил иммунометрический иммуноанализ, основанный на усиленной люминесценции (система “Амерляйт”). Так же как и система “Дель- фия”, этот метод обладает высокой чувствительностью и специфичностью. Он оптимален при обследовании населения на гипотиреоз, так как позволяет определять содержание свободного тироксина в концентрации 7 пмоль/л. Возможность определения низких уровней ТТГ (менее 0,1 мМЕ/мл) позволяет использовать этот метод для диагностики субклинических форм гипер- тиреоза.
Электрохимический метод иммуноанализа. Одновременно с разработкой ИФА были созданы и применены электроды для определения биологических молекул. Первые электроды конструировались на основе ферментов в силу высокой специфичности их взаимодействия с субстратом. На этом принципе основано определение глюкозы, мочевины и других соединений. В настоящее время существует два типа электрохимических сенсоров — амперометрические и потенциометрические. Электрохимический гормональный иммуноанализ используется в эндокринологии, позволяя определять широкий спектр стероидных гормонов и гормонов щитовидной железы. Этот метод лишен многих недостатков, свойственных спектроскопическим методам регистрации сигналов.
Иммуноанализ методом подсчета частиц. Способность Ат к агглютинации используется в иммуноанализе с латексной агглютинацией. До последнего времени этот метод применялся в основном для качественного анализа, например в диагностике беременности по уровню хорионического гонадотропина (ХГ). В последние годы удалось создать систему гомогенного анализа или иммуноанализа методом подсчета частиц. Последнее осуществляет автоматизированный анализатор. Метод по чувствительности превосходит IRMA. Важно, что на результаты анализа не влияет присутствие сопутствующих веществ в биологической пробе.
Необходимо подчеркнуть, что применение любого метода должно отвечать задачам диагностики. Не следует полагать, будто современные неизотопные методы более совершенны. В ряде случаев по точности получаемых результатов они уступают РИА.
ЛИТЕРАТУРА
Панков Ю.А. Пептидные гормоны и современные проблемы биотехнологии//Пробл. эндокринол. — 1996. — № 2. — С. 3—8.
Розен В.Б. Основы эндокринологии. — М., МГУ, 1994. — 250 с.
De Groot L.J. Endocrinology. — W.B.Saunders Company, 1989. — 500 p.
Norman A.W., Litwack G. Hormones. — Acad. Press inc., 1987.
Теппермен Дж., Теппермен X. Физиология обмена веществ и эндокринной системы: Пер. с англ. — М.: Мир, 1989. — 637 р.
Tsai M.-J., O’Malley B.W. Molecular mechanisms of action of steroid/thyroid receptor superfamily members//Ann. Rev. Biochem. — 1994. — Vol. 63. — P. 451—486.
Felig Ph., Baxter J.D., Frohman L.A. Endocrinology and Metabolism. — 3ed. — USA, 1995.
Jeffcoat S.L. EfTeciencv and Effectiveness in the Endocrine Laboratory. — Acad. Press. UK, 1981.
Collins IV.P. (ed). Alternative Immunoassay. — USA, 1980.
Wientraub B.D. (ed). Molecular Endocrinology. Basic Concepts and Clinical Correlations. — Raven Press. — N 8. — 1995.