Продукты брожения известны человеку с незапамятных времен, хотя истинная причина этого явления была установлена Л. Пастером только в 1861 г. Он открыл три основных типа брожения: спиртовое, молочнокислое и маслянокислое. Брожению подвергаются различные органические вещества, и в зависимости от их природы и свойств микроба можно получать те или иные продукты.
К настоящему времени наиболее полно изучены механизмы сбраживания углеводов. В. Н. Шапошниковым и его сотрудниками установлена двухфазность брожения углеводов. В первой фазе происходит интенсивный биосинтез веществ клетки из углеводов и в среде образуются окисленные продукты брожения.
Во второй фазе биосинтез клеточного материала замедляется, а в среде появляются более восстановленные продукты. Восстановленными продуктами брожения могут быть различные спирты, органические кислоты, ацетон, бутанол и другие вещества. Различают спиртовое, молочнокислое, маслянокислое, пропионо- вокислое и другие виды брожения.
Спиртовое брожение. Сбраживание углеводов микроорганизмами до этилового спирта и углекислоты составляет сущность спиртового брожения. Возбудителями спиртового брожения являются дрожжи - одноклеточные эукариотные микроорганизмы. Некоторые бактерии в анаэробных условиях также способны осуществлять спиртовое брожение, например, Sarcina ventriculi, Erwinia emylovora. Энергию получают путем сбраживания углеводов, при котором в среде накапливается этиловый спирт, уксусная и молочная кислота, выделяется углекислый газ, водород. Оба вида бактерий осуществляют разложение глюкозы до пировиноградной кислоты гликолитическим путем, далее следуют реакции декарбоксилирования пировиноградной кислоты до ацетальдегида и восстановление последнего до этилового спирта.
Гетероферментативные молочнокислые бактерии образуют спирт из глюкозы, расщепляя ее по пентозофосфатному пути.
Выделенная из сока агавы бактерия Zymomonas mobilis вызывает спиртовое брожение глюкозы, разлагая ее по пути
Энтнера-Дудорова (КДФГ-путь). Образовавшийся пируват декар- боксилируется, затем восстанавливается в этиловый спирт и углекислый газ. Выход продуктов брожения не отличается от такового при брожении по гликолитическому пути, но энергии выделяется в два раза меньше, чем при гликолизе: на одну молекулу сбраженной глюкозы образуется одна молекула АТФ. Широкое практическое применение в производстве спирта микробиологическим путем имеют дрожжи. Это одноклеточные неподвижные микроорганизмы с овальной или эллипсоидальной формой клеток.
Дрожжи - аэробы, энергию получают в процессе дыхания, но в анаэробных условиях осуществляют спиртовое брожение, расщепляя углеводы по гликолитическому пути. В условиях аэрации процесс спиртового брожения подавляется и активируется дыхание. Подавление спиртового брожения кислородом получило название «эффекта Пастера». «Эффект Пастера» рассматривается как результат конкурирующего взаимодействия энергетических путей, в частности, гликолиза и дыхания, функционирующих у дрожжей. Одним из проявлений является конкуренция за АДФ и неорганический фосфат между субстратным и окислительным фосфорилированием. При понижении внутриклеточной концентрации АДФ и Фн тормозится расщепление глюкозы и образование спирта.
Дрожжи широко распространены в природе. Они встречаются на фруктах, ягодах, растениях, в почве, воздухе. Дрожжи подразделяют на культурные и дикие. К культурным относятся те, которые имеют техническое применение (например, виноградные и хлебопекарные). Они характеризуются высокой бродильной способностью. Дикие дрожжи вовсе не обладают бродильными свойствами или они слабо выражены.
Возбудителями спиртового брожения являются дрожжевые грибки рода Saccharomyces. Сюда относятся все дрожжи, применяемые в промышленности для получения спирта. Дрожжи спиртового брожения делятся на расы верхнего и нижнего брожения (верховые и низовые).
Верховые дрожжи развиваются при доступе кислорода, образуя на поверхности слабую пленку. Брожение идет при температуре 20-24° С, сопровождается обильным выделением углекислоты и образованием пены, дрожжевые клетки при этом выносятся на поверхность среды. К верховым принадлежат отдельные расы дрожжей Saccharomyces cerevisiae. В диком состоянии в природе они не встречаются.
Дрожжи нижнего брожения осуществляют этот процесс при более низкой температуре (4-10° С). Брожение протекает спокойнее и медленнее при образовании компактного осадка дрожжей. К низовым дрожжам относятся Sacch. ellipsoideus.
Спиртовое брожение используется для производства спирта, глицерина, различных вин, в том числе шампанского, пива и коньяка, а также в хлебопечении. Исходным сырьем для получения спирта служат углеводы различного происхождения (крахмалсодержащие продукты - картофель, злаки, отходы сахарной промышленности - меласса, содержащая 50-60 % сахарозы), широко используются также гидролизаты древесины, отходы целлюлозно-бумажной промышленности, так называемые сульфитные щелока.
В связи с отсутствием у низовых дрожжей фермента амилазы крахмал непосредственно не сбраживается. Поэтому предварительно производится осахаривание его так называемыми осахаривающими ферментами, к которым относятся а- и р-амилазы, декстриназа. Осахаривающие ферменты превращают крахмал в сахар мальтозу, сбраживаемый дрожжами. Источниками осахаривающих ферментов являются солод (пророщенное зерно) и препараты плесневых грибов родов Mucor и Aspergillus. В последние годы солод вытесняется более активными ферментными препаратами грибного происхождения.
Брожение обычно ведут в кислой среде при pH 4,0-4,5 (кислая среда подавляет развитие посторонней микрофлоры, особенно нежелательных масляно-кислых бактерий), оптимальной температуре 30° С и концентрации сахара 10-15 % (повышение содержания сахара затрудняет брожение, а при 30-35 % оно почти полностью прекращается).
Процесс спиртового брожения идет по пути Эмбдена- Мейергофа, описанного выше Суммарно его можно выразить уравнением:
СбН,206 gt; 2C2HsOH + 2СО2 + 28 ккал.
В щелочной среде вместо этилового спирта образуется глицерин и уксусный альдегид:
При спиртовом брожении образуется янтарная кислота и сивушные масла - смесь амилового, изоамилового, бутилового и других спиртов. Это продукты дезаминирования аминокислот, служащих источником азотистого питания дрожжей.
Брожение осуществляется в специальных аппаратах - ферментерах при постоянной температуре. Сначала среду аэрируют для стимуляции роста дрожжей, затем устанавливают анаэробные условия, благоприятствующие брожению. Брожение ведется до тех пор, пока концентрация образующегося спирта не подавит рост дрожжей (10-15 %). Полученная бражка поступает в перегонные аппараты, где производится отгонка спирта. При одноразовой перегонке получается спирт-сырец (этиловый спирт и летучие примеси). Он используется для технических целей. При дальнейшей очистке - фракционной дистилляции - получается спирт-ректификат, содержащий 95,6 %.
В настоящее время этиловый спирт получают также и синтетическим путем - из побочных продуктов крекинга нефти (этилена). Синтетический способ вытесняет биохимический, так как он обходится дешевле.
Молочнокислое брожение. Анаэробное превращение углеводов под действием микроорганизмов с образованием в среде значительных количеств молочной кислоты составляет сущность молочнокислого брожения. Этот тип брожения был изучен Л. Пастером в 1857 г.
Чистую культуру молочнокислых бактерий впервые выделил Д. Листер в 1877 г. из кислого молока.
Молочнокислые бактерии не составляют в морфологическом отношении однородную группу. Сюда входят грамположительные неспорообразующие палочки разной длины, относящиеся к роду Lactobacillus и кокки из родов Streptococcus и Pediococcus. Молочнокислые бактерии относятся к факультативным анаэробам.
Они неподвижны, весьма требовательны к питательным средам. Зависимость данных бактерий от наличия готовых органических веществ говорит о слабо развитых биосинтетических способностях. Многие из них нуждаются в аминокислотах, витаминах, азотистых основаниях. В качестве источников энергии молочнокислые бактерии используют сахара и спирты. В отношении углеводов у них наблюдается довольно выраженная специфичность: одни
используют лактозу, другие мальтозу. Лактозу потребляют бактерии, развивающиеся в молоке и молочных продуктах, мальтозу - те, которые сбраживают растительные материалы.
По образующимся в процессе брожения продуктам, молочнокислые бактерии разделяются на две группы: гомоферментативные и гетероферментативные. К гомофермен- тативным относятся палочковидные бактерии рода Lactobacillus и стрептококки. Они образуют из сахара только молочную кислоту и не дают каких-либо побочных продуктов. К гетероферментативным относятся палочковидные бактерии рода Betabacterium и кокки рода Leuconostoc. И те, и другие являются обитателями растений. Помимо молочной кислоты, они образуют из сахара ряд других веществ; спирты, эфиры, уксусную кислоту, водород, углекислоту и др. Гетероферментативный стрептококк Str. diacetilactis дополнительно продуцирует ароматообразующее соединение ацетоин, или ацетил метил карбинол, придающий молочнокислым продуктам приятный аромат.
Общая формула гомоферментативного молочнокислого брожения может быть представлена следующим уравнением:
С6Н1206 gt; 2СН3СНОНСООН + 22,5 ккал.
¦
Гомоферментативные бактерии расщепляют глюкозу гликолитическим путем. Молочнокислое брожение для них является единственным способом получения энергии.
Гетероферментативные молочнокислые бактерии не содержат основных ферментов гликолиза: альдолазы и триозофосфат-
изомеразы. Поэтому начальное расщепление глюкозы у них происходит по пентозофосфатному пути. Образующиеся в процессе расщепления фосфоглицериновый альдегид и а цетил фосфат превращаются в разные конечные продукты брожения. Так, Leuconostoc mesenteroides помимо молочной кислоты образует: этанол и углекислоту, а при сбраживании рибозы эта же бактерия продуцирует молочную кислоту, уксусную и углекислоту.
На молочнокислом брожении основано изготовление молочнокислых продуктов - простокваши, кефира, ацидофилина, кумыса, а также квашение капусты, силосование кормов и др. Для приготовления молочнокислых продуктов используется свежее высококачественное пастеризованное молоко или сливки, к которым добавляют свежую культуру соответствующих молочнокислых микроорганизмов. Последние активно размножаются, образуют молочную кислоту и тем самым подавляют развитие гнилостных бактерий, так как для них кислая среда является неблагоприятной Например, для приготовления простокваши используется чистая культура «болгарской палочки» - Lact. bulgaricus. Она в отличие от других молочнокислых бактерий активнее образует молочную кислоту.
Для приготовления таких молочных продуктов, как кефир, кумыс, йогурт, используются не чистые культуры, а их ассоциации с дрожжами. Кефир, к примеру, готовят из молока, внося в него кефирные зерна, представляющие собой комочки свернувшегося казеина и содержащие симбиотический комплекс молочнокислых бактерий (Str. lactis, Lact. caucasicum), дрожжей (Torula kefiri и Torula ellipsoidea) и ряда других микроорганизмов, вызывающих пептонизацию молока. Ацидофилин готовят путем внесения в пастеризованное молоко Lactobacillus acidophilus и Str. lactis. Молочнокислые бактерии широко применяются также при приготовлении масла и различных видов сырья.
Молочнокислое брожение лежит в основе квашения овощей и заготовки силоса. Возбудителями процесса являются бактерии, которые находятся на поверхности растений. Это молочнокислые стрептококки и различные виды Betabacterium и Leuconostoc На силос идет зеленая растительная масса - листья сахарной свеклы, кукурузы, люцерна, трава. Ее плотно укладывают в специальные резервуары - силосные башни или траншеи. Вначале в этой массе развиваются самые разнообразные микроорганизмы, в том числе молочнокислые и гнилостные бактерии. Но по мере сбраживания
углеводов, содержащихся в растениях, происходит накопление молочной кислоты, кислотность силоса повышается до губительной для гнилостных бактерий концентрации (pH ниже 4,5). Кроме того, в процессе активного роста микроорганизмов быстро используется кислород и создаются анаэробные условия. Все это приводит к прекращению развития большинства микроорганизмов, и в силосной массе начинают преобладать молочнокислые стрептококки и Leuconostoc. Последующий этап брожения осуществляют более кислотоустойчивые молочнокислые бактерии рода Lactobacillus.
Маслянокислое брожение. В отличие от спиртового и молочнокислого брожения маслянокислое брожение происходит в строго анаэробных условиях. Типичный возбудитель его Clostridium butyricum относится к облигатным анаэробам, широко распространен в почвах и сточных водах. Маслянокислое брожение вызывают й другие виды анаэробных бактерий. Все они споровые и относятся к роду Clostridium. В протоплазме клеток содержится гликоген и гранулеза. В качестве источника энергии маслянокислые бактерии используют различные углеводы, спирты и кислоты. Они могут также использовать и некоторые полисахариды - крахмал, декстрин, гликоген. При брожении в преобладающем количестве образуется масляная кислота, сопутствующими продуктами являются этиловый и бутиловый спирты, уксусная кислота, углекислота и водород.
Маслянокислое брожение протекает гликолитическим путем до образования пировиноградной кислоты. Затем следует ключевая реакция - разложение пирувата до ацетил-КоА и С02 с образованием восстановленного ферредоксина. Реакцию катализирует фермент пируват: ферредоксин-оксидоредуктаза.
Синтез масляной кислоты начинается с конденсации двух молекул ацетил-КоА при участии фермента тиолазы. В результате образуется ацетоацетил-КоА, который через ряд промежуточных продуктов восстанавливается в бутирил-КоА. Масляная кислота получается при последующем переносе КоА с молекулы бутирил-КоА на ацетат.
* Ацетил-КоА + Бутират (масляная кислота).
Образующийся ацетил-КоА может быть использован для синтеза АТФ. Маслянокислое брожение дает более высокий энергетический выход, чем спиртовое или молочнокислое: на 1 моль сброженной глюкозы 3,3 моля АТФ.
Некоторые клостридии, в частности С. acetobutyricum наряду с масляной кислотой образуют в значительных количествах бутанол, изопропанол, ацетон, т.е. способны осуществлять ацетоно-бутиловое брожение. При этом, вначале образуется масляная кислота, затем по мере подкисления среды индуцируется синтез ферментов, действие которых приводит к накоплению бутанола и ацетона. Так как данные продукты являются нейтральными растворителями, брожение, осуществляемое клостридиями, приобрело большое техническое значение. Маслянокислое брожение используется также для получения масляной кислоты, которая применяется в кожевенной промышленности. Исходным сырьем служат крахмалсодержащие продукты и отходы свеклосахарного производства.
В природных условиях маслянокислое брожение активно протекает на дне водоемов, содержащих отложения ила, и на дне болот, где нет доступа кислорода.
Пропионовокислое брожение. Образование пропионовой кислоты при брожении углеводов присуще бактериям рода Propaombactenum. Это грамположительные, неподвижные, не образующие спор палочковидные бактерии. В зависимости от условий развития клетки могут иметь булавовидную, вильчатую или разветвленную формы Известно 8 видов пропионовокислых бактерий. Типовой вид - Р. freudenreichii. Пропионовые бактерии отличаются от молочнокислых более совершенным конструктивным метаболизмом, в связи с чем могут расти на простой синтетической среде е аммонийным азотом при наличии в среде биотина и пантотеновой кислоты. Они обитают в рубце и кишечнике жвачных животных, участвуя в образовании жирных кислот. В воде и почве не обнаруживаются. Пропионовокислые бактерии используют в сыроделии и микробиологической промышленности для получения витамина Ваг-
Пропионовые бактерии - аэротолерантные анаэробы. Энергию в основном получают при брожении углеводов, расщепление
которых осуществляют гликолитическим путем. Но кроме этого основного пути у некоторых видов выявлено наличие ферментов пентозофосфатного пути, цикла трикарбоновых кислот, электрон- транспортной цепи. Функционирование этих путей зависит от условий развития бактерий.
Образование пропионовой кислоты из пирувата происходит сложным путем (рис.7.5). В отличие от предыдущих типов брожения здесь имеет место усложнение молекулы пирувата за счет присоединения к ней С02. Присоединение углекислоты происходит путем карбоксилирования с образованием дикарбоновых кислот.
Эта реакция широко распространена среди всех гетеротрофных прокариот, а также растений и животных. Она получила название гетеротрофной ассимиляции углекислоты. Реакцию катализирует биотинзависимая карбокситрансфераза. На первом этапе образуется щавелево-уксусная кислота (ЩУК) и пропионилкоэнзим А. Затем ЩУК через яблочную и фумаровую кислоты восстанавливается до янтарной. Далее с помощью КоА-трансферазы осуществляется перенос КоА-группы с пропионил-КоА на янтарную кислоту, в
результате чего образуется сукцинил-КоА и пропионовая кислота. Сукцинил-КоА превращается в метилмалонил-КоА и снова вступав! в реакции с пируватом, а пропионовая кислота выделяется из клетки и накапливается в среде.