Такие наркотические субстанции, как опиаты (метадон), кокаин, конопля, амфетамины, фенциклидин, наиболее часто употребляемые в среде наркозависимых, в связи с чем они были включены в протокол Национального института лекарственной зависимости США (NIDA). Проводимые аналитические тесты должны соответствовать двум критериям: быть специфичными и чувствительными, а методика анализа должна быть точной и четкой. Под специфичностью понимается точное определение субстанции из смеси с другими сопутствующими веществами.^Под чувствительностью понимается возможность определять минимально низкие концентрации субстанции с минимальным статистическим отклонением. Чтобы определить наличие субстанции, вызывающей зависимость, в биологических жидкостях вначале проводится скрининговый тест, при положительном результате далее проводится подтверждающий тест, базирующийся на физико-химических свойствах субстанции.
В скрининговых тестах используются иммунохимические методы, характеризующиеся высокой чувствительностью и быстротой исполнения. Высокая чувствительность метода позволяет уменьшить число ложнонегативных результатов, и в тоже время лимит определения может включать ложнопозитивные результаты. Аналитические методы, основанные на реакции антиген/антитело, обычно проявляют специфичность к группе структурных химических аналогов. Это имеет большое значение при определении группы препаратов, таких, например, как барбитураты, бензо- диазепины, что суживает дальнейшие исследования для подтверждения лекарственной зависимости. Перекрестная реактивность в таких анализах имеет положительное значение.
В других ситуациях возможна перекрестная реактивность подобных метаболитов от разных по химическим свойствам субстанций, что затрудняет поиск субстанции, вызывающей зависимость.
В последние годы появилось немало методов, способствующих объективизации состояния больных наркологического профиля, среди них:
Среди вышеперечисленных методов, для организации надлежащего режима лабораторного контроля в наркологических стационарах, значение имеют те, которые обеспечивают быстрое и простое в исполнении определение ПАВ в биологических жидкостях. Скрининговые тесты, как для общего, так и для количественного определения просты и дешевы, они лишь выявляют наличие веществ. Подтверждающие же тесты более комплексные, дорогие и медленные, обычно это газовая хроматография, мас- спектрометрия.
Быстрые тесты представляют собой компактную и удобную в эксплуатации реализацию иммунохроматографического анализа (ИХА), позволяющего выявлять в моче наиболее распространенные наркотические вещества (опиоиды, кокаин, амфетамины и каннаби- оиды). Принцип работы методики заключается в том, что при нанесении в достаточном количестве моча поднимается по капиллярам тест-полоски, на которой происходит процесс конкурентного связывания ограниченного количества свободных антител, содержащегося в материале прокладки с ПАВ или его метаболитом, с одной стороны, и антигенами, покрывающими нитроцеллюлозную мембрану, с другой. Результат исследования проявляется в виде окрашивания специальных тестовых и контрольных зон.
Избирательность метода вполне достаточна для скрининг- диагностики состояний наркотической интоксикации в подавляющем большинстве случаев. В стационарной практике, с учетом
интенсивной фармакотерапии, потенциально способной исказить результаты исследования, избирательность любого метода должна подвергаться строгой проверке при соблюдении качественных и количественных требований.
Лимиты качественного (LOD) и количественного (LOQ) определения применяются в лабораториях, занимающихся анализом материала от пациентов с лекарственной зависимостью. LOD является минимальной концентрацией субстанции, определяемой при данном уровне достоверности, a LOQ — минимальной концентрацией субстанции, определяемой количественно, приданном уровне точности. Таким образом, LOD устанавливает минимальную концентрацию, при которой возможно определить присутствие или отсутствие субстанции качественным путем, a LOQ устанавливает нижний лимит количественного определения субстанции. Лаборатории устанавливают лимиты определения, независимо от концентраций, используемых в рутинных тестах.
Важным фактором, дающим возможность позитивной или негативной идентификации субстанции, является порог чувствительности, т.е. лимит концентрации. Анализ на наличие субстанции считается позитивным, если ее концентрация равняется или чуть выше выбранного порога. Чувствительность метода анализа характеризуется минимально возможной для идентификации концентрацией субстанции или ее метаболитов; концентрация субстанции или ее метаболитов в образце, ниже которой анализ не считается достоверным, называется лимитом определения. Обычно лимиты чувствительности находятся в пределах известного уровня, достигаемого введением типичной дозы. Время определения субстанции в биологической пробе может меняться в зависимости от выбранного порога. Например, при выбранном пороге 100 нг/мл метаболиты конопли могут определяться в течение 35 дней после употребления, а при пороге в 20 нг/мл субстанция может определяться только 8 дней или больше.
Пороговая концентрация — это не то же самое, что чувствительность или лимит количественного определения. Она обычно превышает чувствительность или лимит количественного определения. Это утверждение должно приниматься во внимание, когда количественное содержание находится близко лимита определения, и отрицательный результат может быть принят как положительный. Анализ на содержание субстанций, вызывающих зависимость, проводится в два этапа: на первом — предварительное подтверждение наличия субстанции в образце обычным иммуно- ферментным методом, который реагирует на многочисленные метаболиты; на втором — хроматографическое определение одного метаболита. Пороговая концентрация метаболитов должна определяться суммированием результатов обоих определений. Пороговые концентрации веществ, определяемые этими методами, представлены в таблице 2.
Таблица 2
Пороговые концентрации, используемые в диагностических целях
При интерпретации результатов необходимо принимать во внимание количество употребленного вещества, время, прошедшее после употребления до отбора пробы, выбранный метод определения пороговой концентрации, тип биологической жидкости для анализа. Положительный результат анализа указывает лишь на то, что больной употребил субстанцию, но не дает информации о дозе, времени и способе приема. Поэтому диагноз лекарственной зависимости остается клиническим диагнозом токсиколога. В случае отрицательного результата часто возникают вопросы о чувствительности метода. Другими словами, некоторое количество субстанции присутствует, но оно ниже выбранного порога концентрации. При этом следует учитывать:
Все эти вопросы не праздны, принимая во внимание использование дорогостоящей аппаратуры для анализа и консервации мочи.
Следует отметить, что если больной настаивает на уединении при отборе пробы мочи, то это должно происходить в помещении, не имеющем водопровода и больной должен входить туда без верхней одежды. Чтобы исключить возможность подмены образца, необходимо сразу же проверить такие параметры, как количество, температура (32-36°С), цвет, pH, удельную плотность, креатинин. При проведении иммуноферментного анализа присутствие в моче таких веществ, как хлориды, бикарбонаты, лимонный сок, жидкие детергенты, перекись водорода, может негативно влиять на результаты
Интерпретация результатов химических и клинических тестов приводится в таблице 3.
Интерпретация результатов анализа биологических жидкостей
Таблица 3
Стратегией анализа является схема принятой программы исследования, которая включает начальный и подтверждающий тесты, которые устанавливают порог. Целью начального исследования является определение наличия субстанции в пробе, а также скрининг-тесты для отделения большого числа негативных проб от проб, дающих положительные результаты. За первичным анализом образцов, дающих положительные результаты, следует специфический подтверждающий тест, чувствительность которого выше чувствительности первичных скрининг-тестов. Методы подтверждения отделяют ложноположительные результаты, добавляют специфичности химическому анализу. Положительные результаты дают пробы, где концентрация субстанции выше пороговой концентрации, установленной в скрининг-тестах. Тесты подтверждения проводятся на аппаратуре, определяющей физико-химические свойства субстанции, чем и отличаются от скрининг-тестов.
При проведении скрининговых тестов, таких, например, как иммуноферментный анализ могут произойти погрешности из- за того, что метаболиты субстанции, вызывающей зависимость, взаимодействуют между собой. В связи с чем возникает необходимость в наиболее селективном исследовании, т. е. хроматографии. Этот подтверждающий тест разделяет отдельные метаболиты. При этом важно отметить, что пороговые концентрации при скрининговом и при подтверждающем тесте различные. Таким образом, если иммуноферментный метод является скриниг-тестом, то хроматография является тестом подтверждения.
Таблица 4
Пороговые концентрации, используемые NIDA в скрининговых и подтверждающих тестах в г/мл в Dept, of Health and Human Services
*-дельта 9-тетрагидроксиканнабиноло-9 карбоксиловая кислота
101
В таблице 4 приведены пороговые концентрации для скрининговых тестов и пороговая концентрация одного метаболита в тесте, подтверждающем употребление субстанции. Различные пороговые концентрации могут употребляться в клинических и диагностических, но не в судебных целях.
Иммуноферментные методы классифицируются по маркерам и системам определения.
RIA (Radio Immuno А5$ау) — радиоиммунный метод, в его основе лежит маркировка антигена изотопом, обычно Тритиум или Иод 125. Методика анализа предусматривает разведение пробы, прибавление радиоактивного вещества, и антисыворотки, инкубация, сепарирование свободных несвязанных фракций. Радиоактивность накапливается в одной из двух фракций.
EMYT-Syva (Enzyme Multiplied Immunoassay Technique) — множественный иммуноферментный апарат. Радиоактивным изотопом метят фермент, активность которого определяется спектрофотометрически после конкурентной реакции холодового антигена (анализируемый) и меченого антигена до достижения равновесия. Активность фермента, измеренная прямо или косвенно, прямо пропорциональна концентрации анализируемого антигена. Метод не требует предварительной подготовки мочи.
FIA (Flour Immuno Assay) — флуоресцентный иммуноферментный метод. Изотопом маркируется флуоресцентная молекула. Интенсивность флуоресценции определяется после соответствующего разделения на свободную и связанную фракцию. Наиболее часто используется поляриметрия флуоресцирующих веществ. Кювета, где происходит реакция взаимодействия отмеченной субстанции и специфического антитела, подогревается. Фильтр флуориме- тра улавливает отклонение поляризованного луча. Это отклонение обратно пропорционально концентрации субстанции. Калибровочная кривая строится по 6 точкам с использованием китов, измеряющих концентрацию. Избирается пороговая концентрация.
KIMS (kinetic interactions of microparticles in solution) — кинетическое взаимодействие микрочастиц в растворе. Этот новый аналитический метод с использованием прибора COBAS, дает возможность определить наличие субстанции, вызывающей зависимость в малом объеме мочи. Если субстанция находится в растворе в несвободном состоянии, свободные антитела связываются между собой, образуя агрегаты вокруг микрочастиц. Если же
определяемая субстанция находится в растворе, она конкурирует за связь с микрочастицами, и таким образом ингибирует образование агрегатов. Степень абсорбции из раствора прямо пропорциональна концентрации субстанции в пробе.
НЗ (Hemoaglutination Inhibition). Субстанция взаимодействует с антителом, если концентрация субстанции достаточная, чтобы связать все антитела, то добавленные эритроциты будут агглютинировать и осаждаться на дне пробирки. Этот тест очень прост и не требует специальной аппаратуры, может применяться при отсутствии токсикологической лаборатории.
Хроматография считается подтверждающим методом качественного и количественного определения. Это достаточно специфический и индикативный метод определения отдельной субстанции, обычно это метаболит субстанции, вызывающей зависимость. Хроматография дает возможность выделить отдельные вещества из смеси путем распределения в различных фазах: подвижной и неподвижной. Неподвижная фаза обычно содержится в колонке или пластинке и представляет собой твердое вещество или жидкость, а подвижной фазой является газ или жидкость. Разделение зависит от неподвижной фазы если неподвижная фаза — твердое вещество, то действует механизм адсорбции-разделения; разделение субстанций происходит в соответствии с их полярностью благодаря ионному обмену и вытеснению молекулы. При использовании жидкости в качестве неподвижной фазы разделение субстанций происходит на основе их различной растворимости и физико-химических свойств.
Недостаток хроматографического метода в том, что он очень трудоёмок, требует высокого профессионализма аналитика и специального лабораторного опыта. Необходима также предварительная подготовка образца. Решающим является выбор элюента, способный экстрагировать исследуемое вещество из биологической матрицы.
Существуют следующие методы хроматографии:
Хроматография в тонком слое (ТСХ) наиболее простая, результативная и не требует дорогой хроматографической техники. На хроматографическую пластинку наносится неподвижная фаза, которая разделяет различные вещества по их физико-химическим свойствам. Неподвижная фаза, состоящая из силикагеля, целлюлозы или др. наносится слоем толщиной менее 1 мм на стеклянную или пластиковую пластину Подвижная фаза подымает вещества по хроматографической пластине с разной скоростью на разную высоту. Определение вещества происходит после обработки пластины реактивами или в УФ-свете. Rf-коэффициент специфичен для каждого вещества и характеризует соотношение пути, пройденного на пластине исследуемым веществом и растворителем. ТСХ является не слишком достоверным методом, особенно, когда она используется в качестве подтверждающего теста после иммуноферментного теста, и имеет низкую чувствительность. Результаты зависят от условий проведения хроматографии и опыта аналитика. Использование недавно созданных неподвижных фаз, стандартизованных систем, а также компьютерных программ (Тоху Lab) позволили снизить погрешность этого метода.
Газовая хроматография (ГХ) — масспектрометрия наиболее часто применяется для идентификации субстанций, вызывающих зависимость, а также отдельных метаболитов. Газовый хроматограф, совмещенный с масспектрометром, представляет собой эталонный аппарат для определения субстанций, вызывающих зависимость в биологических жидкостях, сочетает в себе высокую Чувствительность и специфичность Образец помещается в испаритель, пропускается мобильная фаза — инертный газ, который разделяет субстанции в зависимости от степени поляризации, точки кипения и молекулярного веса. В газовой хроматографии наиболее часто используются газовые колонки, пламенноионизационный детектор (для разделения углеводородов), щелочной пла- менноионизациоонный детектор (для разделения органических веществ, содержащих азот, фосфаты).
Электронный детектор используется для определения веществ с высоким сродством к электролитам, галогенов, нитратов, карбонатов. Определение ведется по времени удерживания — интервал от времени введения субстанции до максимального пика на детекторе, также по относительному времени удерживания, которое определяется сравнением со временем удерживания стандарта (индекс Ковача).
Для получения наиболее достоверного результата при ГХ необходимо прибавить к образцу внутренний стандарт в начале анализа. Если молекулу разбить в испарителе пучком электронов с высокой кинетической энергией, то она распадается на характерные фрагменты с меньшей массой. Специфическая фрагментация зависит от природы молекулы и от условий ионизации. Соединение газовой хроматографии с масс-спектрометрией делает количественное определение субстанции особенно точным (в нг). В определении используются пороговые концентрации, полученные иммуноферментными методами.
Из-за высокой стоимости этого метода и высоких требований к профессионализму аналитика этот метод не может быть использован как рутинный.
Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) высокого давления на колонку, используется для определения веществ с высокой молекулярной массой, низкой летучестью и термической нестабильностью. Аппарат представляет собой емкость, где находится подвижная фаза, несколько насосов для создания высокого давления, инжектор и хроматографическую колонку от 5 до 30см длиной. Аппарат снабжен также детектором, обычно это УФ-спектрометр (или спектрофлуорометр, или электрохимический детектор), способный постоянно считывать ток, проходящий через колонку. Аналитические данные (хроматограммы, условия хроматографирования) заносятся в память персонального компьютера.
При проведении исследования следует учитывать продолжительность определения в моче субстанций, вызывающих лекарственную зависимость. Количественное определение субстанции в моче может проводиться в течение некоторого периода после приема этой субстанции. Этот период зависит от принятого количества, метаболизма индивидуума (функции печени и почек, хронического приема идр.), концентрации мочи, селективности аналитического метода и пороговой концентрации.
В приведенной таблице 5 собраны данные о времени присутствия в моче и времени возможного определения субстанций, вызывающих зависимость. Иммунохимические анализы, описанные выше, могут проводиться только в оборудованной лаборатории и обеспечивать диагностику.
Важно отметить, что результаты анализа мочи показывают лишь присутствие или отсутствие субстанции, вызывающей зависимость, они базируются на выбранной пороговой концентрации. Нельзя судить по результатам анализа о количестве субстанции, времени приема, присутствии или отсутствии отклонений в поведении, продолжительности времени после приема.
Подтверждающие методы анализа требуют более высокой квалификации персонала, сложного оборудования и длительного времени проведения. Данные не могут претендовать на специфичность, но они индикативны. Поэтому рационально иметь два типа лабораторий: более простые для проведения быстрых иммунохи- мических тестов и лабораторий второго уровня для проведения подтверждающих тестов определения субстанций, вызывающих зависимость. Третий уровень лабораторий подразумевает проведение высокопрофессиональных инструментальных анализов и обучающего консультирования.
С
В скрининговых тестах используются иммунохимические методы, характеризующиеся высокой чувствительностью и быстротой исполнения. Высокая чувствительность метода позволяет уменьшить число ложнонегативных результатов, и в тоже время лимит определения может включать ложнопозитивные результаты. Аналитические методы, основанные на реакции антиген/антитело, обычно проявляют специфичность к группе структурных химических аналогов. Это имеет большое значение при определении группы препаратов, таких, например, как барбитураты, бензо- диазепины, что суживает дальнейшие исследования для подтверждения лекарственной зависимости. Перекрестная реактивность в таких анализах имеет положительное значение.
В других ситуациях возможна перекрестная реактивность подобных метаболитов от разных по химическим свойствам субстанций, что затрудняет поиск субстанции, вызывающей зависимость.
В последние годы появилось немало методов, способствующих объективизации состояния больных наркологического профиля, среди них:
- быстрые, одномоментные стрип-тесты — тесты в виде узких полосок специального материала, представляющих собой иммуно-хроматографическое устройства, меняющие цвет при наличии ПАВ и его метаболитов в тестируемом образце мочи;
- диагностические системы для выявления состояний хронической интоксикации ПАВ по концентрации антител к ПАВ в крови (качественное или полуколичественное определение антител методом иммуноферментного анализа);
- диагностические системы для выявления состояний хронической интоксикации ПАВ по их содержанию в волосах и ногтях методом хромато-масспектрометрии.
Среди вышеперечисленных методов, для организации надлежащего режима лабораторного контроля в наркологических стационарах, значение имеют те, которые обеспечивают быстрое и простое в исполнении определение ПАВ в биологических жидкостях. Скрининговые тесты, как для общего, так и для количественного определения просты и дешевы, они лишь выявляют наличие веществ. Подтверждающие же тесты более комплексные, дорогие и медленные, обычно это газовая хроматография, мас- спектрометрия.
Быстрые тесты представляют собой компактную и удобную в эксплуатации реализацию иммунохроматографического анализа (ИХА), позволяющего выявлять в моче наиболее распространенные наркотические вещества (опиоиды, кокаин, амфетамины и каннаби- оиды). Принцип работы методики заключается в том, что при нанесении в достаточном количестве моча поднимается по капиллярам тест-полоски, на которой происходит процесс конкурентного связывания ограниченного количества свободных антител, содержащегося в материале прокладки с ПАВ или его метаболитом, с одной стороны, и антигенами, покрывающими нитроцеллюлозную мембрану, с другой. Результат исследования проявляется в виде окрашивания специальных тестовых и контрольных зон.
Избирательность метода вполне достаточна для скрининг- диагностики состояний наркотической интоксикации в подавляющем большинстве случаев. В стационарной практике, с учетом
интенсивной фармакотерапии, потенциально способной исказить результаты исследования, избирательность любого метода должна подвергаться строгой проверке при соблюдении качественных и количественных требований.
Лимиты качественного (LOD) и количественного (LOQ) определения применяются в лабораториях, занимающихся анализом материала от пациентов с лекарственной зависимостью. LOD является минимальной концентрацией субстанции, определяемой при данном уровне достоверности, a LOQ — минимальной концентрацией субстанции, определяемой количественно, приданном уровне точности. Таким образом, LOD устанавливает минимальную концентрацию, при которой возможно определить присутствие или отсутствие субстанции качественным путем, a LOQ устанавливает нижний лимит количественного определения субстанции. Лаборатории устанавливают лимиты определения, независимо от концентраций, используемых в рутинных тестах.
Важным фактором, дающим возможность позитивной или негативной идентификации субстанции, является порог чувствительности, т.е. лимит концентрации. Анализ на наличие субстанции считается позитивным, если ее концентрация равняется или чуть выше выбранного порога. Чувствительность метода анализа характеризуется минимально возможной для идентификации концентрацией субстанции или ее метаболитов; концентрация субстанции или ее метаболитов в образце, ниже которой анализ не считается достоверным, называется лимитом определения. Обычно лимиты чувствительности находятся в пределах известного уровня, достигаемого введением типичной дозы. Время определения субстанции в биологической пробе может меняться в зависимости от выбранного порога. Например, при выбранном пороге 100 нг/мл метаболиты конопли могут определяться в течение 35 дней после употребления, а при пороге в 20 нг/мл субстанция может определяться только 8 дней или больше.
Пороговая концентрация — это не то же самое, что чувствительность или лимит количественного определения. Она обычно превышает чувствительность или лимит количественного определения. Это утверждение должно приниматься во внимание, когда количественное содержание находится близко лимита определения, и отрицательный результат может быть принят как положительный. Анализ на содержание субстанций, вызывающих зависимость, проводится в два этапа: на первом — предварительное подтверждение наличия субстанции в образце обычным иммуно- ферментным методом, который реагирует на многочисленные метаболиты; на втором — хроматографическое определение одного метаболита. Пороговая концентрация метаболитов должна определяться суммированием результатов обоих определений. Пороговые концентрации веществ, определяемые этими методами, представлены в таблице 2.
Таблица 2
Пороговые концентрации, используемые в диагностических целях
|
Субстанции |
нг/мл |
|
метаболиты конопли |
20 |
|
амфетамин |
300 |
|
опиаты |
300 |
|
РСР, фенциклидин |
25 |
|
бензодиазепины |
300 |
|
барбитураты |
300 |
|
метадон |
300 |
При интерпретации результатов необходимо принимать во внимание количество употребленного вещества, время, прошедшее после употребления до отбора пробы, выбранный метод определения пороговой концентрации, тип биологической жидкости для анализа. Положительный результат анализа указывает лишь на то, что больной употребил субстанцию, но не дает информации о дозе, времени и способе приема. Поэтому диагноз лекарственной зависимости остается клиническим диагнозом токсиколога. В случае отрицательного результата часто возникают вопросы о чувствительности метода. Другими словами, некоторое количество субстанции присутствует, но оно ниже выбранного порога концентрации. При этом следует учитывать:
- Как много жидкости выпил больной, чтобы разбавить концентрацию мочи.
- Принимает ли больной субстанцию спорадически.
- Принял ли он субстанцию недавно.
- Подменил ли пробу мочи водой или другой жидкостью.
- Подменил ли пробу мочи другой пробой.
Все эти вопросы не праздны, принимая во внимание использование дорогостоящей аппаратуры для анализа и консервации мочи.
Следует отметить, что если больной настаивает на уединении при отборе пробы мочи, то это должно происходить в помещении, не имеющем водопровода и больной должен входить туда без верхней одежды. Чтобы исключить возможность подмены образца, необходимо сразу же проверить такие параметры, как количество, температура (32-36°С), цвет, pH, удельную плотность, креатинин. При проведении иммуноферментного анализа присутствие в моче таких веществ, как хлориды, бикарбонаты, лимонный сок, жидкие детергенты, перекись водорода, может негативно влиять на результаты
Интерпретация результатов химических и клинических тестов приводится в таблице 3.
Интерпретация результатов анализа биологических жидкостей
Таблица 3
|
Результат |
Химическая интерпретация |
Клиническая интерпретация |
|
Положительный |
Субстанция присутствует в биологических жидкостях |
Субстанция была принята |
|
Отрицательный |
Субстанция отсутствует |
Субстанция не была принята
—лрошло много времени с момента приема |
|
Ложно положительный |
|
|
|
Ложно отрицательный |
|
Разведение мочи приемом жидкости |
Стратегией анализа является схема принятой программы исследования, которая включает начальный и подтверждающий тесты, которые устанавливают порог. Целью начального исследования является определение наличия субстанции в пробе, а также скрининг-тесты для отделения большого числа негативных проб от проб, дающих положительные результаты. За первичным анализом образцов, дающих положительные результаты, следует специфический подтверждающий тест, чувствительность которого выше чувствительности первичных скрининг-тестов. Методы подтверждения отделяют ложноположительные результаты, добавляют специфичности химическому анализу. Положительные результаты дают пробы, где концентрация субстанции выше пороговой концентрации, установленной в скрининг-тестах. Тесты подтверждения проводятся на аппаратуре, определяющей физико-химические свойства субстанции, чем и отличаются от скрининг-тестов.
При проведении скрининговых тестов, таких, например, как иммуноферментный анализ могут произойти погрешности из- за того, что метаболиты субстанции, вызывающей зависимость, взаимодействуют между собой. В связи с чем возникает необходимость в наиболее селективном исследовании, т. е. хроматографии. Этот подтверждающий тест разделяет отдельные метаболиты. При этом важно отметить, что пороговые концентрации при скрининговом и при подтверждающем тесте различные. Таким образом, если иммуноферментный метод является скриниг-тестом, то хроматография является тестом подтверждения.
Таблица 4
Пороговые концентрации, используемые NIDA в скрининговых и подтверждающих тестах в г/мл в Dept, of Health and Human Services
|
Субстанции |
Скрининговые тесты |
Подтверждающие тесты |
|
Метаболиты марихуаны |
100 |
15* |
|
Метаболиты кокаина |
|
|
|
Бензоилекгонин |
300 |
150 |
|
Амфетамин |
1000 |
500 |
|
Фенциклидин |
25 |
25 |
|
Опиаты (морфин, кодеин) |
300 |
300 |
*-дельта 9-тетрагидроксиканнабиноло-9 карбоксиловая кислота
101
В таблице 4 приведены пороговые концентрации для скрининговых тестов и пороговая концентрация одного метаболита в тесте, подтверждающем употребление субстанции. Различные пороговые концентрации могут употребляться в клинических и диагностических, но не в судебных целях.
Иммуноферментные методы классифицируются по маркерам и системам определения.
RIA (Radio Immuno А5$ау) — радиоиммунный метод, в его основе лежит маркировка антигена изотопом, обычно Тритиум или Иод 125. Методика анализа предусматривает разведение пробы, прибавление радиоактивного вещества, и антисыворотки, инкубация, сепарирование свободных несвязанных фракций. Радиоактивность накапливается в одной из двух фракций.
EMYT-Syva (Enzyme Multiplied Immunoassay Technique) — множественный иммуноферментный апарат. Радиоактивным изотопом метят фермент, активность которого определяется спектрофотометрически после конкурентной реакции холодового антигена (анализируемый) и меченого антигена до достижения равновесия. Активность фермента, измеренная прямо или косвенно, прямо пропорциональна концентрации анализируемого антигена. Метод не требует предварительной подготовки мочи.
FIA (Flour Immuno Assay) — флуоресцентный иммуноферментный метод. Изотопом маркируется флуоресцентная молекула. Интенсивность флуоресценции определяется после соответствующего разделения на свободную и связанную фракцию. Наиболее часто используется поляриметрия флуоресцирующих веществ. Кювета, где происходит реакция взаимодействия отмеченной субстанции и специфического антитела, подогревается. Фильтр флуориме- тра улавливает отклонение поляризованного луча. Это отклонение обратно пропорционально концентрации субстанции. Калибровочная кривая строится по 6 точкам с использованием китов, измеряющих концентрацию. Избирается пороговая концентрация.
KIMS (kinetic interactions of microparticles in solution) — кинетическое взаимодействие микрочастиц в растворе. Этот новый аналитический метод с использованием прибора COBAS, дает возможность определить наличие субстанции, вызывающей зависимость в малом объеме мочи. Если субстанция находится в растворе в несвободном состоянии, свободные антитела связываются между собой, образуя агрегаты вокруг микрочастиц. Если же
определяемая субстанция находится в растворе, она конкурирует за связь с микрочастицами, и таким образом ингибирует образование агрегатов. Степень абсорбции из раствора прямо пропорциональна концентрации субстанции в пробе.
НЗ (Hemoaglutination Inhibition). Субстанция взаимодействует с антителом, если концентрация субстанции достаточная, чтобы связать все антитела, то добавленные эритроциты будут агглютинировать и осаждаться на дне пробирки. Этот тест очень прост и не требует специальной аппаратуры, может применяться при отсутствии токсикологической лаборатории.
Хроматография считается подтверждающим методом качественного и количественного определения. Это достаточно специфический и индикативный метод определения отдельной субстанции, обычно это метаболит субстанции, вызывающей зависимость. Хроматография дает возможность выделить отдельные вещества из смеси путем распределения в различных фазах: подвижной и неподвижной. Неподвижная фаза обычно содержится в колонке или пластинке и представляет собой твердое вещество или жидкость, а подвижной фазой является газ или жидкость. Разделение зависит от неподвижной фазы если неподвижная фаза — твердое вещество, то действует механизм адсорбции-разделения; разделение субстанций происходит в соответствии с их полярностью благодаря ионному обмену и вытеснению молекулы. При использовании жидкости в качестве неподвижной фазы разделение субстанций происходит на основе их различной растворимости и физико-химических свойств.
Недостаток хроматографического метода в том, что он очень трудоёмок, требует высокого профессионализма аналитика и специального лабораторного опыта. Необходима также предварительная подготовка образца. Решающим является выбор элюента, способный экстрагировать исследуемое вещество из биологической матрицы.
Существуют следующие методы хроматографии:
- ТСХ — тонкослойная хроматография;
- ВРТСХ — высокоразрешающая хроматография в тонком слое;
- ГХ — газовая хроматография;
- ВЭЖХ — высокоэффективная жидкостная хроматография;
- ГХ-МС — газовая хроматография — масспектрометрия.
Хроматография в тонком слое (ТСХ) наиболее простая, результативная и не требует дорогой хроматографической техники. На хроматографическую пластинку наносится неподвижная фаза, которая разделяет различные вещества по их физико-химическим свойствам. Неподвижная фаза, состоящая из силикагеля, целлюлозы или др. наносится слоем толщиной менее 1 мм на стеклянную или пластиковую пластину Подвижная фаза подымает вещества по хроматографической пластине с разной скоростью на разную высоту. Определение вещества происходит после обработки пластины реактивами или в УФ-свете. Rf-коэффициент специфичен для каждого вещества и характеризует соотношение пути, пройденного на пластине исследуемым веществом и растворителем. ТСХ является не слишком достоверным методом, особенно, когда она используется в качестве подтверждающего теста после иммуноферментного теста, и имеет низкую чувствительность. Результаты зависят от условий проведения хроматографии и опыта аналитика. Использование недавно созданных неподвижных фаз, стандартизованных систем, а также компьютерных программ (Тоху Lab) позволили снизить погрешность этого метода.
Газовая хроматография (ГХ) — масспектрометрия наиболее часто применяется для идентификации субстанций, вызывающих зависимость, а также отдельных метаболитов. Газовый хроматограф, совмещенный с масспектрометром, представляет собой эталонный аппарат для определения субстанций, вызывающих зависимость в биологических жидкостях, сочетает в себе высокую Чувствительность и специфичность Образец помещается в испаритель, пропускается мобильная фаза — инертный газ, который разделяет субстанции в зависимости от степени поляризации, точки кипения и молекулярного веса. В газовой хроматографии наиболее часто используются газовые колонки, пламенноионизационный детектор (для разделения углеводородов), щелочной пла- менноионизациоонный детектор (для разделения органических веществ, содержащих азот, фосфаты).
Электронный детектор используется для определения веществ с высоким сродством к электролитам, галогенов, нитратов, карбонатов. Определение ведется по времени удерживания — интервал от времени введения субстанции до максимального пика на детекторе, также по относительному времени удерживания, которое определяется сравнением со временем удерживания стандарта (индекс Ковача).
Для получения наиболее достоверного результата при ГХ необходимо прибавить к образцу внутренний стандарт в начале анализа. Если молекулу разбить в испарителе пучком электронов с высокой кинетической энергией, то она распадается на характерные фрагменты с меньшей массой. Специфическая фрагментация зависит от природы молекулы и от условий ионизации. Соединение газовой хроматографии с масс-спектрометрией делает количественное определение субстанции особенно точным (в нг). В определении используются пороговые концентрации, полученные иммуноферментными методами.
Из-за высокой стоимости этого метода и высоких требований к профессионализму аналитика этот метод не может быть использован как рутинный.
Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) высокого давления на колонку, используется для определения веществ с высокой молекулярной массой, низкой летучестью и термической нестабильностью. Аппарат представляет собой емкость, где находится подвижная фаза, несколько насосов для создания высокого давления, инжектор и хроматографическую колонку от 5 до 30см длиной. Аппарат снабжен также детектором, обычно это УФ-спектрометр (или спектрофлуорометр, или электрохимический детектор), способный постоянно считывать ток, проходящий через колонку. Аналитические данные (хроматограммы, условия хроматографирования) заносятся в память персонального компьютера.
При проведении исследования следует учитывать продолжительность определения в моче субстанций, вызывающих лекарственную зависимость. Количественное определение субстанции в моче может проводиться в течение некоторого периода после приема этой субстанции. Этот период зависит от принятого количества, метаболизма индивидуума (функции печени и почек, хронического приема идр.), концентрации мочи, селективности аналитического метода и пороговой концентрации.
В приведенной таблице 5 собраны данные о времени присутствия в моче и времени возможного определения субстанций, вызывающих зависимость. Иммунохимические анализы, описанные выше, могут проводиться только в оборудованной лаборатории и обеспечивать диагностику.
Важно отметить, что результаты анализа мочи показывают лишь присутствие или отсутствие субстанции, вызывающей зависимость, они базируются на выбранной пороговой концентрации. Нельзя судить по результатам анализа о количестве субстанции, времени приема, присутствии или отсутствии отклонений в поведении, продолжительности времени после приема.
Подтверждающие методы анализа требуют более высокой квалификации персонала, сложного оборудования и длительного времени проведения. Данные не могут претендовать на специфичность, но они индикативны. Поэтому рационально иметь два типа лабораторий: более простые для проведения быстрых иммунохи- мических тестов и лабораторий второго уровня для проведения подтверждающих тестов определения субстанций, вызывающих зависимость. Третий уровень лабораторий подразумевает проведение высокопрофессиональных инструментальных анализов и обучающего консультирования.
С