MED24INfO

  Приведенные ниже методы не используются в ежедневной практике, однако для целого ряда исследований они незаменимы. Предложенные варианты достаточно просты и воспроизводимы.

1. Репликационные варианты G- и R-дифференциального окрашивания хромосом

Использование аналогов тимидина — 5-бромдезоксиуридина (БДУ) или 5-флуородезоксиуридина (ФДУ) позволяет получить дифференциальную окраску хромосом. Рисунок дифференциальной исчерченнос- ти основан на разновременной репликации ДНК G- и R-блоков в S- фазе клеточного цикла. Введение БДУ в культуру в начале S-периода позволяет получить рисунок, аналогичный G-исчерченности, в конце S-периода — R-рисунок.
Растворы (приготавливать на дистиллированной воде для инъекций)

1. БДУ — 1 мг/мл.
2. Тимидин — 1 мг/мл.
3. Бромистый этидий — 1 мг/мл.

1. Репликационный G-рисунок

Протокол 4.1. (для клеток хориона)

1. Поставить кратковременную 24-часовую культуру (см. Протокол 1.6).
2. В начале культивирования (если ворсины в среде находились в холодильнике — то перед тем, как перенести флаконы в термостат) ввести БДУ в конечной концентрации 25-30 мкг/мл.
3. Через 12 часов культивирования ворсинки отмыть в небольшой порции среды и поместить во флаконы с культуральной средой прежнего состава (без БДУ). Для получения более четкого рисунка добавить тимидин в конечной концентрации 20-25 мг/мл. Культивирование продолжать в течение следующих 12 часов.
4. За 1-2 часа до фиксации в культуру ввести колхицин в конечной концентрации 0,5 мкг/мл. Во избежание чрезмерной конденсации хромосом одновременно ввести бромистый этидий в конечной концентрации 5-10 мкг/мл.

Протокол 4.2 (для клеток амниотической жидкости и лимфоцитов)

1. Культивирование клеток проводить в соответствии с общепринятыми методами (см. раздел 1.1, 1.2 и 1.5).
2. За 16-20 часов до фиксации в культуру ввести БДУ в конечной концентрации 15-25 мкг/мл.
3. За 6-7 часов до фиксации культуру лимфоцитов перенести в стерильные центрифужные пробирки, дважды промыть культуральной средой (по 4-5 мл), осаждая клетки центрифугированием при 1000 об/мин в течение 7-10 мин, ресуспендировать в свежей порции питательной среды и ввести тимидин в конечной концентрации 20-25 мкг/мл.
4. При культивировании амниоцитов среду, содержащую БДУ, удалить, промыть монослой 1-2 сменами теплой (+37 °С) среды, в свежую порцию питательной среды добавить тимидин. Концентрации БДУ и тимидина, а также временные интервалы такие же, как и для лимфоцитов.

2. Репликационный R-рисунок (RBG, RBA)

Протокол 4.3 (для клеток хориона)
Концентрации вводимых реагентов аналогичны описанным в Протоколе 4.1. Изменить последовательность операций: в начале культивирования ввести тимидин, заменяя его через 12 часов на БДУ Инкубацию в течение первых 12 часов можно проводить и в отсутствии тимидина.
Протокол 4.4 (для клеток амниотической жидкости и лимфоцитов)
Культивирование клеток проводить в соответствии с общепринятыми методами (см. раздел 1.1, 1.2 и 1.5). За 6-7 часов до фиксации в культуру ввести БДУ в конечной концентрации 30 мкг/мл. Для получения более четкой картины исчерченности одновременно с колхицином рекомендуется ввести бромистый этидий в конечной концентрации 10 мкг/мл.
Протокол 4.5 (RBG)
Растворы

1. №echst 33258 — 0,02 %.
2. 5%-й раствор красителя Гимза на 0,1 М фосфатном буфере, рН 6,8.

Техника окрашивания

1. На свежеприготовленные или хранившиеся не более двух недель при комнатной температуре в защищенном от света месте препараты

нанести по 3-5 мл раствора Hoechst.

2. Облучать в течение 80-90 мин ультрафиолетовой лампой, как для получения G-рисунка (см. Протокол 3.4).
3. Смыть покровные стекла проточной дистиллированной водой и окрашивать препарат красителем Г имза.

Протокол 4.6 (RBA)
Растворы

1. 0,1%-й раствор акридинового оранжевого. Раствор красителя пригоден в течение месяца при хранении при +4 °С.
2. 0,1 М Na-фосфатный буфер, рН 6,8-7,0.

Техника окрашивания

1. Нанести на препарат под покровные стекла по 1-2 капли акридинового оранжевого на 1-2 мин.
2. Смыть покровные стекла и промыть препарат проточной дистиллированной водой.
3. Препарат заключить в 0,1 М Na-фосфатный буфер.
4. Анализировать на люминесцентном микроскопе при длине волны 430-480 нм. При использовании микроскопа серии «Люмам» светофильтр возбуждения ФС в комплексе с фильтром СЗС-24, запирающие светофильтры — ЖС-18 + ЖСС-19 (зеленая пластинка опак-иллюминатора).

Примечания
1) Окрашенный препарат должен флуоресцировать в желто-оранжевом спектре. При избыточном окрашивании (красная область спектра) необходимо промыть препарат 1-2 мин в буфере. Свечение в зеленой области означает, что препарат недокрашен. В этом случае смыть проточной водой покровные стекла, высушить и докрасить препарат акридиновым оранжевым. Небольшое смещение в красную область спектра можно преодолеть, наблюдая за изменением спектра люминесценции в процессе анализа.
Протокол 4.7 Растворы

1. НоесМ 33258 — 0,02 %.
2. 2xSSC, pH 7,0.
3. Растворы для окраски и заключения препаратов см. в разделе «Гибридизация in situ» (Окраска и заключение препаратов, пп. 1-3, 6).

Техника окрашивания
1-2. См. Протокол 4.5.

3. Смыть покровные стекла, поместить препараты в стакан с 2xSSC.
4. Инкубировать в течение 1 часа при 60 °С в 2xSSC.
5. Промыть препараты дистиллированной водой и высушить.
6. Заключить препараты под покровные стекла в раствор красителей (см. Протокол 5.14).
7. Анализировать препараты на люминесцентном микроскопе (см. таблицу в разделе «Гибридизация in situ»).

Протокол 4.8 (иммуноцитохимическая детекция включения БДУ)

1. Препараты метафазных хромосом после инкубирования в присутствии БДУ, денатурировать в 2 М HCl в течение 10-20 минут при комнатной температуре, после чего провести через серию ледяных спиртов 70°, 80° и 96°.
2. Инкубировать препараты в двух сменах фосфатного буфера (1xPBS, рН 7,2) по 10 минут в каждом при комнатной температуре.
3. Нанести на препараты по 150 мкл блокирующего раствора (Boehringer Mannhiem) на 1xPBS, накрыть покровным стеклом и инкубировать 30 минут во влажной камере при температуре +37 °С.
4. На влажные препараты под покровные стекла нанести по 80-100 мкл блокирующего раствора (Boehringer Mannheim) на 1xPBS, содержащего антитела к БДУ (mouse AT-BudR 0,5 мкг/мл). Препараты инкубировать 80 минут во влажной камере при температуре +37 °С.
5. Отмыть препараты в трех сменах фосфатного буфера 1xPBS (pH 7,2), содержащего 0,5 % Tween 20, по 5 минут в каждой, на водяной бане при температуре +43 °С.
6. На влажные препараты под покровные стекла нанести по 100 мкл блокирующего раствора (Boehringer Mannheim) на 1xPBS, содержащего антитела, конъюгированные с FITC (goat-anti-mouse-FITC), в концентрации, рекомендуемой фирмой-изготовителем (Sigma) (0,2 мкг/мл), и инкубировать 60 минут во влажной камере при +37 °С.
7. Препараты отмывать в трех сменах фосфатного буфера 1xPBS (pH 7.2), содержащем 0,5 % Tween 20, по 5 минут в каждой, на водяной бане при температуре +43 °С, ополоснуть дистиллированной водой, дегидратировать в серии спиртов (70°, 80°, 96°) и высушить на воздухе.
8. Окраска и заключение препаратов (условия проведения процедуры и растворы см. Протокол 5.14).
2. Метод выявления ломкой Х-хромосомы

В настоящее время цитогенетические исследования утратили свое значение как единственно возможного метода лабораторной диагностики синдрома Мартина-Белла. Тем не менее, цитогенетический анализ наряду с методами молекулярной генетики и иммуноцитохимии может быть частью комплексной диагностики. Предлагаемый нами вариант приготовления препаратов для регистрации ломкой Х-хромосомы, основанный на использовании так называемого «тимидинового шока», вполне эффективен и доступен для большинства цитогенетических лабораторий.
Растворы

1. Культуральная смесь: 4,9 мл среды RPMI 1640 с глутамином, 0,1 мл эмбриональной телячьей сыворотки, 0,3-0,4 мл цельной гепаринизированной крови.
2. Раствор тимидина: на 4 культуральных флакона 6 мг тимидина развести в 200 мкл дистиллированной воды (из расчета 1,5 мг на пробу, конечная концентрация 0,3 мг/мл).

Протокол 4.9

1. Культивирование лимфоцитов проводить по стандартному полумикрометоду (см. выше). Рекомендуется ставить не менее 4 проб.
2. Общее время культивирования при 37 °С составляет 96 часов (4 суток).
3. Через 72 часа от начала культивирования в каждую пробу ввести 50 мкл раствора тимидина.
4. Дальнейшие этапы (гипотоническую обработку, фиксацию и приготовление препаратов) проводить стандартным способом.
5. Окрашивать препараты рутинным или R-методом.
6. Анализировать по 25-30 метафазных пластинок из каждой пробы.

Примечание
Маркирование прицентромерного района Х-хромосомы с использованием метода FISH существенно облегчает регистрацию ломкого сайта, так как ограничивает наблюдения анализом Х-хромосом.

5. ФЛУОРЕСЦЕНТНАЯ ГИБРИДИЗАЦИЯ IN SITU (FISH)

Метод гибридизации in situ основан на способности хромосомной ДНК образовывать устойчивые гибридные молекулы с ДНК(РНК)- зондами непосредственно на препаратах фиксированных хромосом и интерфазных ядер. С помощью этого метода можно определить точное местоположение практически любой последовательности ДНК или РНК непосредственно в клетке, клеточном ядре или на хромосомах.
Использование метода FISH в цитогенетической диагностике позволяет идентифицировать структурные хромосомные перестройки, устанавливать природу маркерных хромосом, проводить анализ численных нарушений хромосомного набора как на метафазных хромосомах, так и в интерфазных ядрах. Комбинация различно модифицированных проб, выявляемых с помощью разных систем детекции, позволяет одновременно определять местоположение двух и более последовательностей ДНК в одном интерфазном ядре или на одной метафазной пластинке.
В настоящее время для удобства исследователей разработаны коммерческие наборы зондов и реактивов для FISH, которые используются при диагностике наиболее частых численных и структурных аберраций хромосом.
Согласно классической схеме проведения неизотопной гибридизации ДНК-ДНК in situ методики FISH включают приготовление ДНК- зондов, предгибридизационную обработку препаратов, проведение реакции гибридизации, постгибридизационные отмывки, детекцию гибридных молекул, окраску и заключение препаратов.