Наиболее простым и доступным, и поэтому распространенным в клинической цитогенетике является анализ хромосом из лимфоцитов периферической крови. Циркулирующие в кровяном русле клетки в норме не пролиферируют, однако в культуральных условиях митогены (фитогемагглютинин (ФГА), покивид, конканавалин А и др.) стимулируют митотическое деление лимфоцитов. При микрометоде используют цельную капиллярную (из пальца или пятки) кровь, при полумикрометоде и макрометоде — венозную кровь или ее лейкоцитарную фракцию. В любом случае, при взятии крови необходимо строгое соблюдение стерильных условий.
Реактивы
Гепарин (25 000 ед.); культуральная среда (RPMI 1640 или Игла); антибиотики (пенициллин — 100 ед/мл + канамицин — 100 мкг/мл, или гентамицин — 50 мкг/мл); L-глутамин (конечная концентрация 0,2 мг/мл); сыворотка (эмбрионов коров); фитогемагглютинин, колхицин (колцемид).
Протокол 1.1
- В стерильный шприц, содержащий 100-500 ед. гепарина, взять из периферической вены 1-3 мл крови, перемешать.
- В пенициллиновые флаконы добавить: 4,25-4,5 мл среды с антибиотиками и глутамином; 0,75-0,5 мл сыворотки; 0,3-0,5 мл гепаринизированной крови; ФГА в концентрациях, рекомендуемых фир- мой-производителем. Стандартное время культивирования — 72 часа при +37 °С в закрытой системе. Культуру ежедневно перемешивать, осторожно встряхивая флаконы.
- На 71-м часу культивирования, т. е. за 50-60 мин до начала
фиксации, в культуру ввести колхицин (колцемид) в конечной концентрации 0,15-8,0 мкг/мл.
- Содержимое флаконов перенести в центрифужные пробирки, клетки осадить центрифугированием при 1000 об/мин 10 мин, супернатант удалить пипеткой, оставляя 0,3-0,5 мл над осадком. Осадок разбить энергичным встряхиванием и добавить 8-10 мл гипотонического раствора (0,55%-й раствор KCl или смесь 1%-го трехзамещенного цитрата Na и 0,55 % KCl, 1:1), перемешать пипетированием и инкубировать 15-20 мин при 37 °С.
- Фиксация.
Вариант 1. Центрифугировать (10 мин, 1000 об/мин). Осадок тщательно разбить встряхиванием в 0,5 мл надосадочной жидкости. К осадку струйно прилить 8-10 мл холодного свежеприготовленного фиксатора (метанол + ледяная уксусная кислота, 3:1) и перемешать пипетированием. Первую фиксацию проводить при +4 °С в течение 30 мин. Затем фиксатор сменить 3-5 раз, добавляя порции по 5-7 мл.
Вариант 2. С префиксацией: по окончании времени гипотонической обработки в каждую пробу добавить по 0,5—1,0 мл холодного свежеприготовленного фиксатора (метанол + ледяная уксусная кислота, 3:1), перемешать пипетированием и осадить центрифугированием (10 мин, 1000 об/мин). Супернатант удалить, осадок разбить встряхиванием и провести фиксацию как описано выше в варианте 1.
Вариант 3. К осадку каплями добавить 1 мл фиксатора (метанол + ледяная уксусная кислота, 9:1), энергично встряхивая пробирку. Затем струйно прилить еще 9 мл фиксатора. Через 2-3 мин клетки осадить центрифугированием, к осадку прилить 10 мл ледяной уксусной кислоты. Пробирку вручную осторожно встряхивать в течение 10 мин, затем клетки осадить центрифугированием. К осадку прилить 8-10 мл фиксатора 3:1. Через 2-3 мин фиксатор заменить на свежую порцию и продолжить фиксацию в течение 50-60 мин.
- Приготовление препаратов.
Раскапывание суспензии проводить на предметные стекла, охлажденные в морозильной камере или в холодной воде, нанося на препарат с высоты 30-50 см по 30-50 мкл суспензии. Стекла высушить при комнатной температуре. При плохом разбросе хромосом на препарате рекомендуется высушивать стекла над пламенем спиртовки или поджиганием фиксатора.