В зависимости от особенностей материала методы приготовления хромосомных препаратов подразделяются на две категории.
- Прямые методы применяются при исследовании тканей, обладающих высокой митотической активностью (костный мозг, лимфатические узлы, любые ткани эмбриона на ранних стадиях развития и хорион/плацента до 20-й недели беременности), а также при исследовании мейотических хромосом.
- Непрямые методы включают получение препаратов хромосом из любой ткани после стимулирования пролиферации клеток в условиях in vitro. Тип культуры (монослой или суспензия) и длительность культивирования (от нескольких часов и дней до нескольких недель) определяются типом клеток.
В зависимости от стадии клеточного цикла проводятся следующие исследования:
1. Исследования отдельных хромосом и их участков в интерфазных ядрах:
- анализ полового хроматина в клетках буккального эпителия основан на регистрации неактивной Х-хромосомы (Х-хроматин) или гетерохроматинового участка Y-хромосомы (Y-хроматин); используется как ориентировочный тест при диагностике нарушений в системе половых хромосом;
- анализ численных и структурных аномалий, затрагивающих конкретные участки хромосом методом FISH; позволяет получить ограниченную информацию о конкретной аномалии кариотипа, а также повысить производительность традиционного цитогенетического анализа в случаях мозаичных вариантов численных аномалий.
- Исследование профазных хромосом (сперматоциты на стадии пахитены); используется при установлении причин мужского бесплодия.
- Исследование прометафазных хромосом (высокий уровень разрешения); необходимо для цитогенетической диагностики синдромов, обусловленных микроперестройками хромосом.
- Исследование метафазных хромосом (ФГА-стимулированных лимфоцитов, клеток костного мозга, фибробластов кожи, эмбриональных и экстраэмбриональных тканей), полученных прямыми и непрямыми методами; используется для установления хромосомного статуса пациента в клинической и пренатальной цитогенетике.
- Исследование стадий анафазы — телофазы; используется для регистрации специфического воздействия различных мутагенов.
Для исследования препаратов используются различные методы окраски всех хромосом набора, а также индивидуальных хромосом или их отдельных участков. Методы дифференциальной окраски и особенно молекулярно-цитогенетические методы (различные варианты гибридизации in situ) позволяют точно идентифицировать хромосомы человека на разных стадиях развития, в разных тканях и на разных стадиях митоза, установить точную природу хромосомных перестроек, идентифицировать маркерные хромосомы и т. д. Многочисленные методы, позволяющие выявить линейную гетерогенность хромосом, условно можно подразделить на три группы — избирательное связывание красителя (флуорохрома) с определенными нуклеотидами молекулы ДНК; различные предобработки хромосомных препаратов перед окраской неспецифическим красителем (обычно красителем Гимза); исследования, основанные на асинхронности репликации отдельных участков хромосом. Особую группу представляют методы избирательной окраски, использующиеся для специфического выявления отдельных участков хромосом. Для обозначения методов окраски применяется трехбуквенная система, подразумевающая способ получения и визуализации определенного типа сегментации (см. Приложение). В настоящее время разработано также множество методов, позволяющих не только подробно изучить тонкую структуру отдельных районов хромосом, но и получить информацию об их функциональной активности. Так, метод NOR-окраски с использованием азотнокислого серебра позволяет судить о транскрипционной активности /-генов и степени их функционирования, метод ник-трансляции in situ и использование специфических антител — о функциональной активности некоторых блоков генов (см. главу 10).
Протоколы получения различных типов дифференциальной окраски (их световые и люминесцентные варианты), наиболее широко используемые в практике, а также метода неизотопной гибридизации ДНК-ДНК in situ (FISH) приведены в Приложении.