(???) Контрольные вопросы
1. Основные группы нестерильных лекарственных препаратов.
2. Источники попадания микроорганизмов в нестерильные лекар­ственные формы.
3. Поведение микроорганизмов (сапрофитов, условно-патогенных и патогенных) в лекарственной форме или субстрате.
4. Стадии размножения микроорганизмов в жидких, сыпучих, плотных субстанциях и лекарственных формах.
5. Методы микробиологического контроля субстанций и несте­рильных лекарственных форм:
а) выявление энтеробактерий;
б) выявление синегнойной палочки;
в) выявление золотистого стафилококка;
г) выявление грибов (дрожжевых, дрожжеподобных и плесне­вых).
6. Методы и пути предупреждения микробной контаминации суб­станций и нестерильных лекарственных форм.
(!!!) Задания для практической работы
1. Работа с ситуационными задачами по теме, анализ представлен­ных в задаче результатов, выработка заключения, разработка профилактических мер по предупреждению микробной конта­минации.
2. Знакомство с требованиями ГФ XI и Изменений к ГФ XI по группам нестерильных лекарственных форм.
Исходные субстанции для приготовления нестерильных лекар­ственных препаратов часто контаминированы большим количе­ством разнообразных микроорганизмов. Так, среди субстанций и препаратов высокую степень микробной загрязненности имеют: тальк, окись магния, папаверин, фенобарбитал (люминал), кофеин, порошки глюкозы, амидопирина и др. Исследование микробной контаминации этих объектов выявило результаты, представленные в табл. 1.
Таблица 1
Микробная обсемененность лекарственных препаратов, субстанций и др.

Объекты	Микробная обсемененность |
Настои, ароматные воды, миксту­ры, сиропы	до 10 000 микробов в 1 мл
Натрия гидрокарбонат (ХЧ)	3000-50 000 микробов в 1 г
Концентраты из бюреточной установки: натрия гидрокарбонат, маг­ния сульфат, барбитал, аскорбино­вая кислота, мятная вода и др.	микробная обсемененность в нес­колько раз больше, чем у исходных субстанций или растворов
Мазевые основы: желтый вазелин, ланолин, эуцерин и др.	Е. coli и Staph. aureus при +4 оС со­храняются 40-60 дней, при +20 °С — 20-40 дней

Кроме исходной субстанций и сырья, на микробную чистоту лекарственного препарата влияют микроорганизмы, находящиеся на различном оборудовании, с помощью которого производится препарат (весы, дозирующее устройство, устройство для закупорки флаконов и т. д.), вспомогательные материалы и инструменты (фильтры, шпатели, прокладки и т. д.), посуда, воздух производственных помещений, дистиллированная вода, одежда и руки персонала и т. д. Последствия этой контаминации были рассмотрены в разделе «Асептика».
В табл. 2 показано, каким образом микроорганизмы действуют на химические структуры лекарственных препаратов.
Таблица 2
Влияние микроорганизмов на качество лекарств

Род и вид микроба	Препараты	Характер действия микроба
Bacillus mycoides, Bacillus mesenthericus	амидопирин, ан­типирин, кофеин-бензоат нат­рия	используют азот и углерод для синтеза собственных молекул, что ведет к разрушению препа­рата
Proteus vulgaris	амидопирин	разлагает за сутки более 50% препарата
Сапрофиты	а) калия хлорат	а) восстанавливают до калия хлорида;
	б) бруцин	б) окисляют до бруцинхинона
194 различных штам­ма микроорганизм	ацетилхолин	разлагают

Микроорганизмы, попадая в субстанцию или жидкую лекарственную форму, мазь, мазевую основу и т. д., размножаются с разной скоростью (рис. 1). Типичную кривую размножения микроорганизмов в жидкой среде можно разделить на 4 основные стадии.
I. ЛАГ-фаза (4-5 часов) — фаза приспособления микробов к новой среде. Размножения не происходит, происходит рост (увеличение размеров) микробных клеток за счет накопления белка; часть микробов может погибнуть, не приспособившись к новым условиям.
П. ЛОГ-фаза (5-6 часов) — фаза логарифмического роста. Происходит бурное размножение микробов в среде. Микроорганизмы физиологически наиболее активны, выделяют в среду большое количество продуктов метаболизма. Гибели микробов в этой фазе практически не происходит.
III. Стационарная фаза (5-7 часов) — кривая размножения переходит в линию, параллельную нижней оси. Процессы метаболизма идут активно, и среда насыщается продуктами обмена, ухудшаются условия для нормального функционирования микробов, идут процессы отмирания. Число вновь образующихся и отмирающих клеток практически эквивалентно, поэтому кривая размножения и идет горизонтально.
Рис. 1. Кривая роста микроорганизмов
IV. Фаза ускоренной гибели микробов (более 10 часов) — в среде практически не остается источников питания. Микробы резко меняют свои морфологические, физиологические характеристики, что приводит к их гибели.
Эта кривая может видоизменяться в зависимости от вязкости, плотности субстрата, количества в нем воды, консервантов, но принцип сохраняется. Каждая из указанных стадий характеризует то или иное состояние системы «микроорганизм — лекарственный препарат» и тем самым определяет качество препарата в данный временной момент.
Если система «микроорганизм — лекарственный препарат» находится в III или IV стадии, то в зависимости от состава ингредиентов и попавшей в нее микрофлоры могут наблюдаться изменения вкуса, цвета или запаха (органолептические характеристики), выделение газов, появление осадка, хлопьев, плесени или даже изменение консистенции. В этом случае выбраковка идет по органолептическим свойствам.
Наиболее часто подобные изменения отмечается в водных настоях, отварах. При добавлении консервантов этот процесс может удлиниться во времени в несколько раз. Если микробная контаминация происходит в вязких субстанциях и лекарственных формах (мази, мазевые основы и др.), то микробная диффузия резко затрудняется и формируются локальные очаги размножения микробов в виде гнездных очагов (изменение цвета, консистенции, появление плесени и т. д.).
Гораздо сложнее обстоит дело с I и II стадиями. Проблема состоит в том, что бактерии не успевают за это время столь значительно изменить качества субстанции или лекарственного препарата, чтобы это можно было определить органолептически. Именно с I и особенно II стадий развития пирогенные свойства возникают у инъекционных растворов. Нестерильные лекарственные препараты меняют свою лечебную эффективность, приобретают свойства токсичности или инфективности, снижается их способность к длительному хранению. Эти процессы на I и II стадиях не сопровождаются внешними, органолептически определяемыми изменениями.
Все процессы, происходящие на I-IV стадиях развития микроорганизмов в субстрате, могут ускоряться на фоне нарушения санитарных нормативов, микроклимата помещений (температура, влажность, содержание пылевых частиц и т. д.). Например, повышение влажности и температуры воздуха способствует отсыреванию порошков, таблеток с последующей активацией в них жизнедеятельности микроорганизмов.
Растворы в бюреточных установках (концентраты) почти всегда содержат большое количество микроорганизмов (споровые, неспоровые палочки, стафилококки, дрожжевые грибы, сарцины и др.). Концентраты из бюреточной установки в несколько раз более обсеменены, чем исходные растворы, что указывает на нарушение правил санитарного режима эксплуатации бюреточных установок.
В мазевых основах микрофлора может сохраняться длительное время. Так, кишечная палочка, золотистый стафилококк при температуре +4 °С сохраняются в вазелине, белом ланолине и других основах до 60 дней.
Нормативы микробной обсемененности нестерильных лекарственных средств и перечень патогенных бактерий, которые не должны присутствовать в НЛС, представлены в Изменениях к ГФ XI.
Помимо НЛС, в Изменения внесены микробиологические требования к субстанциям и вспомогательным материалам. Учитываются многие параметры: возрастные категории лиц, для которых готовится НЛС; пути введения препарата; происхождение компонентов НЛС (синтетические, природные, животного, растительного и т. д. происхождения).
Требования к приготовлению НЛС и микробиологические нормативы регламентируются Приказом МЗ РФ № 309 (п. 9 и приложение № 12).
Из числа патогенных бактерий, вызывающих заболевания у человека, в НЛС не должны встречаться кишечная палочка, сальмонеллы или вообще представители семейства энтеробактерий (в зависимости от категории препарата и его назначения); из гноеродных — золотистый стафилококк и синегнойная палочка. На этом основании и составляется схема выделения и идентификации микроорганизмов из нестерильных лекарственных средств (рис. 2).
При проведении исследования на микробиологическую чистоту необходимо определить антимикробную активность лекарственного препарата. Определение антимикробного действия препарата проводят при отсутствии явных указаний на наличие консерванта или антимикробного вещества.
Используемые в методике тест-штаммы указаны в разделе «Микробиологический контроль стерильности лекарственных препаратов» данного методического пособия.
Методика
Рис. 2. Схема выделения и идентификации микроорганизмов из нестерильных лекарственных средств
2-я пробирка: 0,1 мл взвеси Candida albicans + (10:1) буферный раствор и лекарственное средство; г=20-25°С, 72 часа;
3-я пробирка: 0,1 мл взвеси Pseudomonas aeruginosa + (10:1) среда № 8 и лекарственное средство; t=35-37 °C, 48 часов;
4-я пробирка: 0,1 мл взвеси Staphylococcus aureus + (10:1) среда № 3 и лекарственное средство; £=35-37 °С, 48 часов;
5-я пробирка: 0,1 мл взвеси Е. coli + (10:1) среда №8 и лекарственное средство; t=35-37°C, 48 часов.
Контроли: пробирки с теми же средами, но без лекарственного средства + тест-штаммы (для оценки жизнеспособности тест-штаммов).

Рис. 2. Схема выделения и идентификации МО из НЛФ
Отсутствие роста в опытных пробирках свидетельствует об антибактериальном действии лекарственного препарата.
При наличии антибактериального действия при испытании на микробиологическую чистоту препарат разводится в 100-200 раз и засевается в данном разведении мерно в необходимые питательные среды или применяются инактиваторы. указанные в фармакопейных статьях. При подсчете колоний необходимо учитывать разведение препарата.
Таблица
Микробиологическая чистота готовых лекарственных средств (ГЛС) (изменения к ГФ XI)
(при отсутствии других требований в частных фармакопейных статьях)

Кате­гория	Применение	Требования
1	Препараты для инъекций, инфузий и других видов парентерального введения; препараты для введения в полость тела, где отсутст­вуют микроорганизмы; глазные препараты; препараты для нанесения на открытые раны, ожоги	Стерильность
2	Средства для местного, трансдермального, интравагинальнго применения; для введения в полости уха, носа; ингаляции.	Не более 102 бактерий и грибов суммар­но в 1 г или в 1 мл; при отсутствии Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus и Епterobacteriaceae
3	Для приема внутрь
а	Детские лекарственные средства (от 0 до 1 года)	Не более 50 бактерий и грибов суммарно в 1 г или в 1 мл при отсутствии Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus и Епterobacteriaceae
б	Детские лекарственные средства	He более 500 аэробных бактерий и 50 дрожжевых и плесневых грибов в 1 г или в 1 мл при отсутствии Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus и Епterobacteriaceae
в	Жидкие лекарственные средства из синтетическо­го сырья (растворы, сиро­пы, капли и др.)	He более 500 аэробных бактерий и 50 дрожжевых и плесневых грибов в 1 мл при отсутствии Е. coli, Salmonella spp.; не более 102 других кишечных бактерий
г	Лекарственные средства из синтетического сырья (таблетки, драже, капсу­лы, гранулы и др.)	Не более 103 аэробных бактерий и 102 дрожжевых и плесневых грибов в 1 г при отсутствии Е coli, Salmonella spp.; не более 102 других кишечных бактерий
д	Жидкие лекарственные средства из сырья растительного, животного или природного происхождения	Не более 5.103 аэробных бактерий, 102 дрожжевых и плесневых грибов в 1 мл при отсутствии Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, E.coli, Salmonella spp-; не более 102 других кишечных бактерий
е	Лекарственные средства из сырья растительного, животного или природного происхождения	Не более 104 аэробных бактерий, 2 • 102 дрожжевых и плесневых грибов в 1 г при отсутствии Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, E.coli, Salmonella spp-; не более 102 других кишечных бактерий
4	Лекарства для ректального введения	Не более 103 аэробных бактерий и 102 дрожжевых и плесневых грибов в 1 г при отсутствии Enterobacteriaceae, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus

Помимо микробной контаминации (ОМЧ и наличие определенных патогенных МО) применяются другие виды микробиологических исследований, представленные на схеме.
(!!!) Практическая работа
Задание 1
Из косметического кабинета поступила жалоба на недоброкачественную партию косметической мази на ланолиновой основе: гнездное разжижение, неспецифический неприятный запах.
Мазь была исследована в бактериологической лаборатории на микробную чистоту согласно нормативам и требованиям ГФ XI: мазь в разведении 1:10 в количестве 1 мл засеяна на плотную среду № 1, в количестве 0,5 мл — на плотную среду Сабуро, в жидкие среды накопления № 1, № 2 (Сабуро), № 3 (для выявления энтеробактерий), № 8 (для выявления стафилококков и синегнойной палочки) по 0,5 мл. После 5-суточной инкубации при 37 "С на плотных питательных средах выявлен рост колоний, а на жидких — равномерное помутнение на средах № 1, № 2, № 8. Из среды № 8 сделан высев на среду № 9 (для выявления пигмента пиоцианина у синегнойной палочки) и на желточно-солевой агар для выделения стафилококков.
Проанализируйте полученные результаты. Сравните их с нормативами. Дайте свое заключение по микробной чистоте данного препарата.
Какой микроб выявлен в данном препарате?
Откуда он мог попасть в мазь?
Как можно установить источник контаминации мази?
Задание 2
В бактериологическую лабораторию для оценки микробиологической чистоты поступил сироп «Бронхолитин», содержащий консервант (этиловый спирт).
Препарат был исследован согласно нормативам и требованиям ГФ XI. Разведение препарата 1:100 было засеяно на плотные среды № 1 в количестве 1 мл и № 2 (Сабуро) — 0,5 мл. В количестве 0,5 мл данное разведение препарата засеяно в жидкие среды накопления: №1, №2 (Сабуро), №3 (для накопления энтеробактерий) и № 8 (для накопления стафилококков и синегнойной палочки).
После 5-суточной инкубации на питательных средах выявлен рост только на среде № 1 (жидкой и плотной).
Проанализируйте полученные результаты. Сравните их с нормативами. Дайте заключение по микробной чистоте данного препарата.
Почему при исследовании данного препарата использовано 100-кратное разведение?
Задание 3
В бактериологическую лабораторию поступили таблетки тетрациклина для исследования на микробиологическую чистоту. Препарат исследовался с соблюдением требований и нормативов ГФ XI.
После предварительного разведения 1:400 тетрациклин в количестве 1 мл был засеян на плотную среду № 1, в количестве 0,5 мл — на плотную среду № 2 (Сабуро) и по 0,5 мл в жидкие среды накопления № 1, № 2 (Сабуро), № 3 (для накопления энтеробактерий) и № 8 (для накопления стафилококков и синегнойной палочки).
После 5-суточной инкубации был выявлен рост в виде колоний только на плотной среде Сабуро и в виде равномерного помутнения также только в среде № 2 (Сабуро).
Проанализируйте полученные результаты. Сравните их с нормативами. Дайте свое заключение по микробной чистоте данного препарата.
Какие микроорганизмы выделены из данного препарата? Чем можно объяснить их присутствие в тетрациклине?
Почему при исследовании данного препарата использовано 400-кратное разведение?
Задание 4
В бактериологическую лабораторию на исследование микробиологической чистоты поступил сухой экстракт корня солодки. Исследование проводилось с соблюдением требований и нормативов ГФ XI.
После предварительного разведения в 10 раз препарат в количестве 1 мл был засеян на плотную среду № 1, в количестве 0,5 мл — на плотную среду № 2 (Сабуро) и в количестве 0,5 мл — на жидкие среды накопления: № 1, № 2 (Сабуро), № 3 (для накопления энтеробактерий) и № 8 (для накопления стафилококков и синегнойных палочек).
После 5-суточной инкубации при 37 °С на плотных питательных средах обнаружен рост микроорганизмов в виде колоний и равномерное помутнение жидких сред накопления: № 1, 2, 3. Из среды № 3 сделан высев на среду Эндо (№ 4 — для выявления кишечной палочки и других энтеробактерий) и на висмут-сульфитный агар (№ 5 — для выявления сальмонелл). Через сутки на среде Эндо отмечен рост лактозо-положительных, грамотрицательных, оксидазо-негативных микроорганизмов.
Проанализируйте полученные результаты. Сравните их с нормативами. Дайте свое заключение по микробной чистоте данного препарата.
Какой микроорганизм выделен из данного препарата?
Каким путем выделенный микроб мог попасть в препарат?
Как можно определить источник контаминации экстракта данным микроорганизмом?
Определение количества жизнеспособных клеток в препаратах из микробов
Материал для исследования: препарат «Бактисубтил».
Цель исследования: определение количества жизнеспособных клеток бактерий штамма Bacillus cereus IP 5832.
1 капсула должна содержать не менее 1 млрд. зародышевых спор!
Методика исследования. В стерильных условиях содержимое одной капсулы вносится в мерный объем стерильного физиологического раствора, из которого готовят последовательные десятикратные или стократные разведения (от 10"1 до 10~8). Из разведения 10"8 делается мерный высев в количестве 1 мл на 2—3 чашки Петри с МПА и заливается 20-30 мл расплавленного и охлажденного до 40-45 °С МПА. Чашки помещаются в термостат на 18-24 часа (t=37°C).
После инкубации производится подсчет колоний на всех чашках и определяется среднее арифметическое, которое является основным для вычисления количества жизнеспособных спор. Для этого найденное среднее количество спор необходимо умножить на разведение.
(!!!) Практическая работа. На исследование поступили 2 серии препарата «Бактисубтил». После выполнения соответствующих разведений, посевов и инкубации в термостате на МПА выявлен рост колоний бацилл.
Произведите подсчет бацилл для каждой серии препарата, сделайте заключение о соответствии нормативам данной лекарственной формы.
Определение идентичности Lactobacillus bulgaricus в препарате «Гастрофарм»
и наличия энтеробактерий (ФС № 42-368-86)
Материал для исследования: таблетки «Гастрофарм».
Цель исследования
1. Микроскопическое определение (на основании морфологических и тинкториальных свойств) микроорганизмов Lactobacillus bulgaricus.
2. Определение энтеробактерий в препарате.
Методика исследования
I этап. Растирают в стерильной ступке 10 таблеток, заливают стерильным физиологическим раствором. Бактериологической петлей забирают взвесь и помещают на 2 предметных стекла. Мазки сушат, фиксируют и окрашивают по Граму и Нейссеру.
При микроскопии мазка, окрашенного по Граму, определяют наличие конгломератов и одиночных грамположительных палочек длиной 5-30 мкм.
При микроскопии мазка, окрашенного по Нейссеру, определяют наличие конгломератов и одиночных палочек длиной 5-30 мкм, с желто-оранжевыми зернами волютина.
II этап. Готовят 10-кратное разведение препарата и засевают на среду № 3 для накопления энтеробактерий. При наличии роста на данной среде делают высев на среду Эндо и висмут-сульфитный агар. Препарат не должен содержать энтеробактерий.
(!!!) Практическая работа. В лабораторию поступил препарат «Гастрофарм» для определения идентичности лактобацилл и контроля энтеробактерий. Промикроскопируйте мазки, определите наличие энтеробактерий и дайте заключение по предложенному препарату.
Определение идентичности ядов, используемых для приготовления лекарственных форм
Материал для исследования: мазь «Випросал», содержащая яд гюрзы.
Цель исследования: определение наличия и идентичности яда гюрзы.
Методика исследования
Основа исследования — реакция преципитации в геле (РП).
1. В преципитационные пробирки разливают 1,5%-й «голодный» агар, смешанный в соотношении 1:1 с сывороткой, содержащей антитела к яду гюрзы (слой № 1).
2. После застывания слоя № 1 поверх него наливают 0,5 мл 0,75%-го МПА (слой № 2, где будет происходить реакция преципитации: антиген-токсин + антитела сыворотки в виде мутного кольца).
3. После застывания слоя № 2 на него наслаивают 0,5 мл предварительно расплавленного при 45 "С препарата. Пробирку закрывают резиновой пробкой и инкубируют в термостате (t=37 °C) в течение 4 суток. После чего, при наличии кольца преципитации, делают заключение об идентичности яда.
Практическая работа. В лабораторию поступили на исследование 2 серии мази «Випросал» для определения наличия и идентичности яда гюрзы. По готовым демонстрационным наборам сделайте заключение об идентичности яда, находящегося в лекарственном препарате.
Определение антимикробной активности прополиса
Цель исследования: определить антимикробную активность препарата.
Методика исследования
Готовится спиртовое разведение порошка прополиса (маточный раствор).
В дозированные 3 объема расплавленного и остуженного до 40 °С МПА вносят такие количества маточного раствора, чтобы получить конечные концентрации прополиса в агаре 0,08; 0,04; 0,02%. Полученные разведения прополиса в агаре разливают по 15 мл в чашки Петри и дают застыть.
Параллельно готовят 2 контрольные чашки:
а) 1 мл спирта этилового (96°) +15 мл МПА (для исключения бактериостатического действия спирта на тест-штамм); б) 15 мл МПА (для подтверждения жизнеспособности тест-штамма).
На все чашки петлей высевают тест-штамм Bacillus cereus 8035 и помещают их на сутки в термостат (t=35—37"С).
После инкубации на контрольных чашках должен наблюдаться рост, что свидетельствует о жизнеспособности тест-штамма и отсутствии бактериостатического действия спирта, являющегося компонентом готовой лекарственной формы (настойки прополиса). Бактериостатическое действие собственно прополиса должно проявляться в концентрации не более 0,08%, о чем будет свидетельствовать отсутствие роста тест-штамма на чашке с данной концентрацией и меньшими.
Практическая работа. На исследование поступили 2 серии препарата. После проведения всех необходимых манипуляций чашки с опытом и контролями были помещены в термостат на сутки.
Оцените полученные на чашках результаты и сделайте заключение по антибактериальной активности двух серий прополиса.
Определение антимикробной активности антибиотиков методом диффузии в агар
Определение антимикробной активности антибиотиков основано на их способности угнетать рост микроорганизмов. Определение проводят методом диффузии в агар на плотной питательной среде путем сравнения размеров зон угнетения роста тест-штаммов, образующихся при испытании растворов определенных концентраций Государственного стандартного образца и испытуемого препарата.
Антимикробная активность антибиотиков выражается в единицах действия (ЕД) или мкг. Для большинства антибиотиков 1 ЕД или мкг соответствуют 1 мкг активного вещества.
Метод определения (трехдозный)
В чашки Петри, установленные на строго горизонтальной поверхности, разливают расплавленные и остуженные до 49±1°С два слоя питательной среды, в верхний из которых засеваются конкретные тест-микробы.
В агаровых слоях чашек делают лунки диаметром 6-8 мм и вносят равные объемы рабочих растворов стандартного (CI, C2, СЗ) и испытуемого (И1, И2, ИЗ) образцов. Концентрации растворов, содержащие малую, среднюю и большую дозы, должны находиться в соотношении 1:2:4. Концентрация раствора С2 должна быть близка к контрольной концентрации раствора стандартного образца, указанной в ГФ XI.
По величине зон задержки роста тест-микроба на основании специальных формул, отражающих зависимость величины зон задержки роста от концентрации, рассчитывают количество антибиотика, содержащегося в исследуемом препарате.
(!!!) Практическая работа. На исследование поступил таблетированный эритромицин. Для определения количества антибиотика в 1 таблетке препарат раститровали согласно требованиям ГФ XI. В работе использовался тест-штамм для эритромицина — Bacillus cereus HB в концентрации 20 млн. спор на 1 мл среды.
Оцените результаты исследования ориентировочно (сравнивая зоны задержки роста испытуемого препарата и стандартного образца) и дайте предварительное заключение о содержании антибиотика в исследуемом препарате.