Доступность воды для микроорганизмов определяется ее активностью в среде (a®), которая зависит от величины осмотического давления, или концентрации растворенных веществ. Чем выше концентрация раствора, тем выше его осмотическое давление и ниже активность воды. Любое вещество, содержащееся в растворителе (в данном случае - воде), притягивает молекулы растворителя и таким образом снижает их подвижность. Численно активность воды (аlt;о) равна отношению давления водяных паров над раствором к давлению паров над чистой водой. Эта величина выражается в долях единицы. Активность воды определяют согласно уравнению:
p
Lco
0 ”1
где aw - активность воды; P - давление водяного пара раствора; Р0 - давление пара чистой воды; ni - число молей воды; п2 - число молей растворенного вещества ( 1 кг воды, или 1 л, содержит 55,51 молей). Для дистиллированной воды affi = i.
Из гипертонических растворов, т. е. из таких, у которых осмотическое давление выше, чем в клетке, микроорганизмы не могут потреблять воду. Это явление известно в биологии как физиологическая сухость. В естественной среде оно имеет место в засоленных почвах и соленых водоемах. Нижние пределы активности воды, в которых возможен рост микроорганизмов, разные для разных видов. Например, для дрожжей родов Candida и Saccharomyces нижний предел аlt;о составляет 0,93 для Вас. subtilis - 0,949, Е. coli - 0,935. Экстремальные галофилы в присутствии NaCl
ф
развиваются при а^ 0,75-0,78. За исключением галофилов, большинство бактерий активнее развивается в питательном бульоне, где активность воды составляет 0,999. Внесение в среду органических и минеральных веществ снижает активность воды. Особенно сильное снижение вызывает внесение NaCl. При концентрации его 27-30 % ащ = 0,8. Глюкоза и сахароза оказывают более слабое влияние на активность воды при содержании их в растворе в таких же количествах, как и NaCl (27-30 %) а« = 1.
Осмотическое давление внутри клеток бактерий соответствует 35-40 атм. Если бактерии поместить в раствор с более высоким осмотическим давлением, то они погибнут в результате плазмолиза, а если раствор имеет более низкое давление, то гибель клеток произойдет от плазмоптиза. Однако наличие ригидной клеточной стенки обеспечивает относительную устойчивость бактерий к колебаниям осмотических условий. Большинство бактерий мало чувствительно к изменению концентраций солей в пределах 0,5-3,0 %.
Более того, известен ряд микроорганизмов, которые нормально развиваются при высоком осмотическом давлении. Например, некоторые виды дрожжей размножаются в меде,
бактерии - в соленой рыбе. Такие микроорганизмы называются осмофильными. В большинстве своем это г ал оф илы (любящие соль), характеризующиеся повышенной потребностью в хлористом натрии. Одни из них слабо галофильные - лучше развиваются на средах, содержащих 2-5 % хлористого натрия. К ним относятся бактерии родов Achromobacter и Pseudomonas, обитающие в морской воде. Другие - крайне галофильные - нуждаются в более высокой концентрации хлористого натрия. Это все виды бактерий рода Halobacterium и ряд бактерий рода Micrococcus и Sarsina.
Крайне галофильные микроорганизмы обнаружены в водах Мертвого моря, солончаковых почвах, а также рассолах для солений продуктов. Они обычно вызывают порчу соленой рыбы и мяса.
Крайне галофильные микроорганизмы, или экстремальные галофилы, адаптированы к существованию в средах повышенного содержания солей за счет поддержания высокой внутриклеточной концентрации растворенных веществ. Так, у Halobacterium nalobium концентрация ионов калия составляет 30-40 % сухого вещества клетки. Потребность в калии у галобактерий может стать столь высокой, что этот ион становится фактором, лимитирующим рост культуры.
Регуляция активности внутриклеточной воды осуществляется клеткой путем изменения концентрации неионных растворенных веществ, таких, как многоатомные спирты, глицерин, арабит. Роль спиртов состоит в том, что они поддерживают низкую величину аш в клетках, выросших при высоких концентрациях солей. Если в клетке концентрация солей ниже, чем в питательной, среде, то активность внутриклеточной воды будет выше, чем в среде. В таком случае бактерии не смогут потреблять воду и развиваться не будут. Клетки регулируют активность внутриклеточной воды путем регуляции синтеза и распада многоатомных спиртов, концентрация которых изменяется в ответ на изменение концентрации солей во внешней среде. Ферментный аппарат экстремальных галофилов хорошо приспособлен к высоким концентрациям солей, особенно ионов калия, преобладающих в цитоплазме. Они необходимы ферментам либо для проявления активности, либо для стабилизации. Потребность в повышенном содержании солей проявляет белоксинтезирующая система галобактерий. Для сохранения стабильности рибосом требуется высокая солевая концентрация - до ЗМ КС1 и 0,1М MgCb, причем КС1 нельзя заменить NaCl, иначе происходит беспорядочная агрегация рибосом. При низких концентрациях солей (0,001 MgCb), поддерживающих в норме структуру рибосом Е. coli, галобактерии теряют большую часть белков. Синтез белка у галофилов активно протекает в присутствии 3,8М КС1. Особенностью белкового синтеза у данных бактерий является нечувствительность к антибиотикам, ингибиторам данного процесса у других бактерий: хлорамфениколу, стрептомицину, эритромицину. Высокие концентрации солей стабилизируют гидрофобные связи и обеспечивают создание активной конфигурации белков экстремально галофильных бактерий, что особенно важно для ферментных белков.
Изучение биохимической основы галофилии показало, что некоторые ферменты крайне галофильных бактерий функционируют только при высоком содержании хлористого натрия. Кроме того, ионы натрия необходимы им для усвоения из среды питательных веществ. Так, Halobacterium solinarium ионы натрия нужны для потребления глутамата; морским псевдомонадам - для потребления сахаров и ряда аминокислот.
Природными средами, где преобладают высокие давления, являются моря и океаны, глубинные месторождения нефти. Гидростатическое давление, как экологический фактор, влияет на распространение и активность микроорганизмов. В океане давление возрастает с глубиной, на каждые 10 м глубины давление повышается на 1 атм. Среднее давление на дне Тихого океана 380 атм. В сочетании с низкой температурой это очень неблагоприятные условия для жизни. Немногие из обычных бактерий способны активно развиваться в данных условиях. Изучение выделенной из морских глубин Ps. batliijeetes показало, что при давлении 1000 атм и 3° С, т.е. условиях, близких к естественным, она развивалась крайне медленно: лаг-фаза длилась около 4 месяцев, время генерации в экспоненциальную фазу составляло 33 сут, в то время
как при 1 атм и 37° С время генерации было менее 1 ч. Даже невысокое гидростатическое давление (50-150 атм) оказывает неблагоприятное биологическое действие. Так, у галобактерий и фотосинтезирующих бактерий происходит разрыв газовых вакуолей, если давление в среде повышается на 5 атм (при норме 1 атм). Отрицательное действие давления усиливается в неблагоприятных условиях температуры и кислотности среды. Особенно возрастает чувствительность бактерий к давлению у крайних нижних границ температурной области роста. При низкой температуре даже невысокое давление 50-100 атм сильно ингибирует рост. Рост Е. coli прекращается даже при 100 атм и 30° С, если pH среды понизить до 5,2. Таким образом, эффект действия повышенного давления зависит от изменения оптимальных условий роста микроорганизмов.
Но в природе существуют бактерии, которые выдерживают огромные давления. Такие бактерии называются барофильными (от греч. baros - тяжесть). Представителем является Вас. submarinus, выделенный из Тихого океана с глубины 5000 м. Из нефтяных скважин изолированы барофильные сульфатредуцирующие бактерии. Они оказались более активными при сравнительно высоком давлении (400-500 атм). Большинство же микроорганизмов относится к баротолерантным и выдерживает довольно высокое давление (630 атм) только в течение 1 ч. При длительном воздействии гидростатического давления происходит денатурация белков и инактивация ферментов.
Повышенное давление оказывает ингибирующее действие на синтез белка. Наиболее чувствительной стадией является аминоацилирование тРНК и связывание ее с рибосомами (полисомами). У некоторых микроорганизмов давление ингибирует транспорт растворенных веществ в клетку и тем самым тормозит их рост. У психрофильных бактерий давление может повреждать клеточную мембрану. Отмечается и ряд других изменений: увеличение скорости некоторых химических и ферментативных реакций; уменьшение объема органических коллоидов; увеличение вязкости жидкостей и повышение электролитической диссоциации.
Максимальное давление, при котором возможен рост того или иного микроорганизма, определяется барочувствительностью жизненно важных физиологических процессов: белкового синтеза, образования и использования АТФ, транспорта растворенных веществ через мембрану, регуляторных функций клетки.