Реакция спонтанного розеткообразования (Е-РОК) характеризует одну из важнейших функций Т-лимфоцитов — их способность к адгезии, первому этапу, с которого начинается взаимодействие клетки с антигеном, а также к кооперации клеток в иммунном ответе.
Методика исследования. Необходимые материалы: гепарин, изотонический раствор натрия хлорида, среда 199, 3% раствор желатина, 25% раствор глютарового альдегида, взвесь эритроцитов барана, центрифужные пробирки, термостат, центрифуга.
К 1,9 мл изотонического раствора натрия хлорида добавляют 0,1 мл гепарина (на 2 пробирки). В пробирку с кровью (3 мл) добавляют 3% раствор желатина из расчета 1 : 3 (3% раствор желатина готовят следующим образом: 10 мл 10% раствора желатина разводят 20 мл среды 199), перемешивают и ставят пробирку в термостат (37° С) на 35 мин, затем надосадочную жидкость отсасывают в центрифужную пробирку и центрифугируют 5 мин при 1000 об/мин. Надосадок отсасывают, а к осадку добавляют 4—5 капель дистиллированной воды для гемолиза эритроцитов. Смесь отсасывают пипеткой и добавляют к ней избыток среды 199 (3—5 мл). Затем центрифугируют при 1000 об/мин в течение 5 мин. Отмывание клеток проводят трижды. Взвесь должна содержать около 2 х 106 клеток в 1 мл.
Приготовление взвеси эритроцитов барана: 0,15 мл эритроцитов барана разводят в 10 мл среды или изотонического раствора натрия хлорида. К 0,1 мл взвеси лимфоцитов добавляют 0,1 мл взвеси эритроцитов барана. Смесь оставляют в термостате при 37° С на 5 мин. Затем взвесь центрифугируют при 1000 об/мин в течение 5 мин и ставят в холодильник (4° С) на 1 ч. К осадку добавляют 2 капли глютарового альдегида (1 мл 25% альдегида разводят в 7,4 мл изотонического раствора хлорида натрия) для фиксации образовавшихся розеток, аккуратно перемешивают и оставляют на 20 мин при комнатной температуре. К взвеси добавляют избыток дистиллированной воды (5 мл) и центрифугируют 5 мин при 1000 об/мин. Из осадка готовят мазки, фиксируют их метиловым спиртом и окрашивают по Романовскому— Гимзе в течение 20 мин. Под микроскопом с иммерсией считают количество розеток (розетка — лимфоцит, прикрепивший к себе 3 и более эритроцитов барана).
Реакция бластной трансформации лимфоцитов в присутствии неспецифического митогена ФГА выявляет еще одно важнейшее свойство лимфоцитов — их способность отвечать трансформацией в активные лимфоциты.
Методика исследования. Необходимые материалы: среда 199, 10% раствор желатина, гепарин, ФГА, стерильные пробирки и флаконы, термостат, центрифуга, микроскоп.
Кровь (2 мл) берут в стерильную пробирку со средой 199. Среду готовят следующим образом: смесь 10 мл среды 199 с 0,1 мл гепарина разливают в пробирки по 1 мл. К смеси добавляют 10% раствор желатина из расчета 1 : 10 и ставят в термостат (37° С) на 40 мин. Надосадочную жидкость отсасывают в пробирку с небольшим количеством эритроцитов, добавляют к ней 3% раствор уксусной кислоты и подсчитывают число клеток в камере Горяева. Оптимальным для реакции является 2 млн клеток в 1 мл. Если число клеток окажется больше, то взвесь разводят до необходимой концентрации средой Игла; если число клеток меньше, то ее центрифугируют и осадок ресуспендируют в соответствующем количестве среды. Затем в суспензию добавляют антибиотики, разведенные средой Игла. Исходный раствор должен содержать по 100 000 ЕД пенициллина и стрептомицина.

1. мл взвеси лимфоцитов переносят во флакон со средой (3 мл), перемешивают и 2 мл полученной взвеси переливают во флакон, где содержится 0,1 мл ФГА. Один флакон без ФГА оставляют как контрольный. Флаконы закрывают резиновыми пробками и ставят в термостат на 72 ч при 37° С. Далее содержимое флаконов переносят в центрифужные пробирки, центрифугируют 5 мин при 1000 об/мин и из осадка готовят мазки, которые фиксируют метиловым спиртом, окрашивают по Романовскому—Гимзе в течение 20 мин и микроско- пируют. При подсчете процента бластной трансформации учитывают сумму бластов и переходных форм из расчета на 100 клеток. Аналогичные подсчеты делают в контроле.

Определение субпопуляций Т-лимфоцитов. Для определения супрессорных и хелперных субпопуляций Т-лимфоцитов используют реакцию с теофиллином. Для этой цели перед постановкой реакции Е-РОК лимфоциты инкубируют в течение 1 ч при 37° С в 0,1 мл среды 199, содержащей 0,2% раствор теофиллина. Хелперами считают лимфоциты, способные формировать Е-РОК после их инкубации с теофиллином (теофиллинрезистентные лимфоциты). Число супрессоров (теофиллинчувствительных лимфоцитов) определяют по разности, полученной после вычитания из общего числа Е-РОК числа хелперов. В норме соотношение хелперов и супрессоров 2 : 1 (40 : 20).
Состояние В-системы иммунитета
Методики определения уровней иммуноглобулинов в сыворотке крови и в секретах подробно описаны в «наставлениях», прилагаемых к коммерческим моноспецифическим сывороткам.
Реакция ЕАС-розеткообразования — метод количественной оценки клеток, несущих поверхностные рецепторы к компонентам комплемента. Число лимфоцитов с поверхностными рецепторами для СЗ-компонента комплемента в основном соответствует числу В-лимфоцитов в периферической крови человека.
Методика исследования. Необходимые материалы и оборудование: среда 199, глютаровый альдегид, эритроциты крупного рогатого скота, 10% раствор желатина, изотонический раствор натрия хлорида, гепарин, центрифуга, пипетки емкостью 0,1 мл, 1 мл, 5 мл, центрифужные пробирки, стеклянные стаканчики, пастеровские пипетки, шприцы емкостью 5 и 10 мл, предметные стекла, световой микроскоп, кролики, мыши.
Выделение лимфоцитов проводится так же, как описано в постановке реакции Е-РОК. Затем к 0,1 мл отмытой взвеси с концентрацией

2. х 106 клеток в 1 мл добавляют 0,1 мл 0,5% взвеси индикаторных частиц (см.) и инкубируют в термостате при 37° С в течение 30 мин. Осаждают взвесь в режиме центрифугирования 150° С 3—5 мин, отстаивают в течение 10 мин при комнатной температуре и образовавшиеся розетки фиксируют глютаровым альдегидом. Приготовление мазков, фиксация, окраска препаратов и подсчет розеткообразующих клеток соответствуют таковым при постановке реакции Е-РОК.

Приготовление индикаторных частиц: эритроциты крупного рогатого скота отмывают 3 раза средой 199 в режиме центрифугирования 150° С 10 мин. Готовят взвесь из 0,5 мл плотного осадка эритроцитов и 1,95 мл среды 199, добавляют 2 мл кроличьей антисыворотки к эритроцитам крупного рогатого скота, взятой в субагглютинирующей концентрации и инкубируют 30 мин при 37° С. Взвесь отмывают средой 199 трижды, центрифугируя в прежнем режиме. К осадку добавляют 1,95 мл среды 199 и 2 мл свежей (!) сыворотки крови мыши, разведенной средой 199 в соотношении 1:5— 1:10, инкубируют 30 мин при 37° С. Отмывают осадок 3 раза средой 199 в прежнем режиме. К отмытому осадку добавляют 9,5 мл среДы 199, ресуспензируют и используют как индикаторные частицы.
Приготовление антисыворотки к эритроцитам крупного рогатого скота: кролика иммунизируют тремя инъекциями в краевую вену уха 10% взвесью на изотоническом растворе натрия хлорида: первая инъекция — 10 мл взвеси, вторая — 5 мл взвеси через 6 ч, третья — 5 мл взвеси через 16—18 ч от начала иммунизации. Через 7 сут от начала иммунизации забирают 30—60 мл венозной крови, отстаивают ее 30 мин при комнатной температуре, обводят сгусток, инкубируют в течение ночи в холодильнике, отделяют сыворотку. Единичные эритроциты удаляют центрифугированием в режиме 1500 об/мин в течение 10 мин. Сыворотку выдерживают в холодильнике не менее 2 ч, затем инактивируют нагреванием в водяной бане при 56° С в течение 30 мин. Титр антител определяют в реакции агглютинации, а затем разливают сыворотку в пробирки, учитывая, что при субагглютинирующем разведении ее средой 199 конечный объем должен составлять 2 мл.
Циркулирующие иммунные комплексы (ЦИК) в организме не всегда приводят к образованию патогенных депозитов, тем не менее установление их в биологических жидкостях и определение их количества могут служить одним из интегральных показателей, позволяющих предположить участие ЦИК в развитии патологического процесса.
Метод преципитации 3,5% раствором полиэтилен- гликоля (ПЭГ). Необходимые материалы и оборудование: изотонический раствор натрия хлорида, 7% раствор полиэтиленгликоля, 0,1 н. раствор NaOH, центрифуга, спектрофотометр, центрифужные пробирки, пипетки емкостью 1 и 5 мл.
Приготовление реактивов. 7% раствор ПЭГ: 7 г ПЭГ (относительная молекулярная масса 6000) растворяют в 100 мл боратного буфера (pH 8,4). Боратный буфер готовят путем смешивания 55 мл 1,24% раствора борной кислоты и 45 мл 1,9% раствора боракса (буры), доводят до 200 мл дистиллированной водой. 3,5% раствор ПЭГ: 20 мл 7% раствора ПЭГ и 20 мл боратного буфера. 0,1 н. раствора NaOH: 4 г NaOH разводят в 1 л дистиллированной воды.
Методика исследования. Сыворотку крови разводят изотоническим раствором натрия хлорида в соотношении 1:25 (0,1 мл + 2,5 мл). Разведенную сыворотку смешивают с 7% раствором ПЭГ в соотношении 1:1 (0,5 мл + 0,5 мл). Для проведения реакции преципитации пробирки помещают в холодильник при 4° С на 18 ч. Пробирки центрифугируют 15 мин при 1500 об/мин и удаляют надосадочную жидкость. Осадок промывают в 0,5 мл 3,5% раствора ПЭГ при тщательном перемешивании. Пробирки центрифугируют повторно 15 мин при 1500 об/мин и удаляют надосадочную жидкость. Далее осадок растворяют в 2,5 мл 0,1 н. раствора NaOH, очень тщательно перемешивают и оставляют при комнатной температуре не менее чем на 30 мин. Пробы замеряют на спектрофотометре, длина волны 280 ммк против 0,1 н. раствора NaOH. Уровни ЦИК выражают в единицах оптической плотности. Уровни ЦИК, определенные методом преципитации 3,5% раствором ПЭГ, в норме не должны превышать 0,110 ед. опт. плотности.
Метод торможения агглютинации латексных частиц, нагруженных IgG человека. Необходимые материалы и оборудование: латекс, нагруженный IgG человека; сывороточный пул от больных ревматоидным артритом (титр ревматоидного фактора по дерматоловой пробе 320—640), 0,2 М раствор ЭДТА (pH 7,6), иммуносорбент, раствор Гамильтона — Патерсона — Якобсона, 0,1% раствор азида Na, ультрацентрифуга, лабораторная центрифуга, пробирки центрифужные, пластмассовые плашки, пипетки емкостью 0,1 мл, 1 мл и 10 мл, термостат, прибор для подсчета частиц фирмы «Медикор», водоструйный насос.
Приготовление реактивов. Иммуносорбент готовят путем сшивки коммерческого у-глобулина глютаровым альдегидом, хранят при температуре 4° С в виде суспензии.
Приготовление сывороточного пула: пул сывороток от больных ревматоидным артритом (титр ревматоидного фактора 320—640 по дерматоловой пробе) центрифугируют на ультрацентрифуге при 105 ООО g в течение 1 ч. Надосадочную жидкость осторожно отсасывают и, добавив в нее 0,02 мл 0,1% раствора азида Na, разливают во флаконы по 0,5—1 мл. Хранится пул при температуре ниже 0° С в замороженном виде.
Сывороточный пул и латексные частицы, покрытые IgG человека, оттитровывают для определения 70—80% агглютинации. Найденное соотношение препаратов используют для постановки реакции торможения агглютинации.
Методика исследования. Сыворотку крови больных комплементи- руют инкубацией при комнатной температуре в течение 10 мин 0,2 М раствором ЭДТА (pH 7,6) в соотношении 1:1 (150 мкл + 150 мкл). 400 мкл иммуносорбента центрифугируют при 1500 об/мин в течение 10 мин и тщательно удаляют надосадочную жидкость. В иммуносорбент вносят 100 мкл декомплементированной сыворотки и инкубируют 20 мин при комнатной температуре. Пробу центрифугируют в течение 10 мин при 1500 об/мин. 50 мкл надосадочной жидкости переносят в пластмассовые плашки для постановки реакции, туда же вносят 50 мкл сывороточного пула (перемешивают) и 50 мкл латексных частиц (перемешивают). Плашки помещают в термостат при 37° С на 1,5 —

2. ч (все пробы имеют дубликаты для точности определения ЦИК). Параллельно определяют максимальную агглютинацию IgG-связанных латексных частиц с сывороточным пулом. Для этого 50 мкл сывороточного пула соединяют с 50 мкл изотонического раствора натрия хлорида и с 50 мкл латексных частиц. Для определения исходного количества латексных частиц, взятых для проведения реакции, ставят контроль— 100 мкл изотонического раствора натрия хлорида с 50 мкл латексных частиц.

После реакции агглютинации из плашек забирают 50 мкл надосадочной жидкости и вносят ее в 10 мл раствора Гамильтона — Паттерсона — Якобсона (9 г NaOH, 0,6 мл 3% раствора ЭДТА, 5 мл 5% раствора формалина, 5 мл трис-буфера, довести объем дистиллированной водой до 1 л). Все тщательно перемешивают. Перед каждой работой этот раствор фильтруют через шотовский фильтр при помощи водоструйного насоса. Раствор считают пригодным для работы, если счет фона (прибор Picoscal) не превышает 40. На этом же приборе производится замер неагглютинированных латексных частиц в пробах. Результаты выражают в процентах и рассчитывают по формуле:
X = — X 100%, а-с
где а — число частиц, добавленных в каждую пробу; b — число частиц, оставшихся после торможения реакции агглютинации иммунными комплексами; с — число частиц, оставшихся после максимальной агглютинации.
Уровни ЦИК, определенные методом торможения реакции агглютинации латексных частиц, у здоровых людей не должны превышать 20%.
Определение лимфоцитов, имеющих мембранные иммуноглобулины. Наличие на поверхности лимфоцитов рецепторов иммуноглобулиновой природы считается достоверным признаком В-лимфоцита. Поэтому подсчет клеток, светящихся под действием меченной флюорохромом антииммуноглобулиновой сыворотки, может быть использован для определения процента этой популяции лимфоцитов в периферической крови или в любом лимфоидном органе.
Техника проведения опыта. Все манипуляции проводят с охлаждением! Кровь, взятую из вены в количестве 4,75 мл, переносят в пробирку (помещенную в ледяную баню), содержащую 0,25 мл 2,7% раствора ЭДТА (трилон В). К 5 мл смеси добавляют 15 мл охлажденного до 4° С изотонического раствора натрия хлорида. Заранее готовят фикол-верографиновый градиент. Берут 40 мл верографина (исходная концентрация 76%) и добавляют к ним 44 мл дистиллированной воды. Из кристаллического порошка фикола приготавливают 9% раствор на дистиллированной воде (брать теплую воду из-за плохой растворимости фикола). Приготовленные исходные растворы смешивают в соотношениях 10,5 мл раствора верографина и 25 мл раствора фикола и охлаждают. Относительная плотность полученной смеси должна быть 1,077. Если при определении с помощью ареометра плотность смеси окажется выше, следует добавлять в нее раствор фикола, постоянно перемешивая, пока плотность не достигнет необходимого значения. Смесь разливают в 4 центрифужные пробирки по 3 мл и осторожно наслаивают по 5 мл подготовленной крови, центрифугируют при 1500 об/мин 40 мин (на холоду). Затем пробирки вынимают и ставят в ледяную баню. На границе градиента отчетливо заметно белое опалесцирующее кольцо. Вначале пастеровской пипеткой осторожно отсасывают надосадочную жидкость над кольцом. Затем также осторожно, стараясь не захватить фикол-верографиновую смесь, отсасывают слой клеток над градиентом (опалесцирующее кольцо) и переносят их в отдельную пробирку. Часть суспензии используют для приготовления мазка, который окрашивают.
При правильно приготовленном градиенте в мазке определяется до 97% лимфоцитов.
Взвесь лимфоцитов из всех пробирок соединяют, клетки отмывают в холодном изотоническом растворе хлорида натрия (pH 7,2—7,4) трехкратным центрифугированием при 1500 об/мин по 10 мин. Иногда при этом лимфоциты склеиваются и следующее отмывание производят изотоническим раствором хлорида натрия, в который добавлен раствор ЭДТА в конечной концентрации 0,5%. Последнее, четвертое, отмывание клеток проводят в изотоническом растворе хлорида натрия (pH 7,2—7,4) без добавления раствора ЭДТА при комнатной температуре. Соблюдение этого условия важно, ибо в противном случае не получится монослоя клеток.
Покровные стекла, предварительно тщательно отмытые и обезжиренные, помещают в 0,5% раствор формвара на дихлорэтане (лучший способ отмывания покровных стекол — замачивание их в течение суток в растворе бихромата калия в концентрированной серной кислоте с последующим тщательным отмыванием в дистиллированной воде и хлороформе). Стекла вынимают из раствора формвара и высушивают над парами хлорэтана, не удаляя от сосуда с раствором. В этом случае стекло остается прозрачным. Если их высушивать на воздухе, то образующаяся пленка становится непрозрачной, стекло мутнеет. Для нанесения взвеси лимфоцитов на предметное стекло с формваровой пленкой пользуются тонким капилляром, из которого при энергичном выдувании 1 капля жидкости выходит приблизительно за 1—2 с. Касаясь концом капилляра поверхности пленки, наносят на стекло каплю суспензии клеток. При этом капля не должна растекаться по стеклу. Стекло помещают во влажную камеру на 10—15 мин. Необходимо, чтобы от момента последнего центрифугирования до момента нанесения взвеси клеток на формваровую пленку прошло не более 10—15 мин, иначе клетки теряют способность прикрепляться к пленке. Эта способность восстанавливается, если клетки вновь промыть в забуференном изотоническом растворе хлорида натрия. Остатки жидкости сливают, а стекло промывают круговыми движениями последовательно в 4 сосудах с изотоническим раствором хлорида натрия (pH 7,2—7,4) при комнатной температуре. Если описанные процедуры выполнены тщательно, то образуется монослой клеток, который можно заметить на покровном стекле в виде участка помутнения. Затем стекло осторожно высушивают (не касаясь монослоя клеток) фильтровальной бумагой, наносят на него люминесцентную сыворотку и помещают во влажную камеру (например, в чашку Петри, на дно которой уложена смоченная водой фильтровальная бумага), а затем в термостат на 15—20 мин. Остатки сыворотки отмывают круговыми движениями в 4 сосудах изотонического раствора хлорида натрия (pH 7,2—7,4). Формваровую пленку на обратной стороне стекла (по отношению к монослою клеток) стирают марлей. Монослой клеток заключают в забуференный глицерин. Для этого маленькую каплю буфер-глицерина наносят на предметное стекло и на нее укладывают покровное стекло монослоем внутрь так, чтобы между предметным и покровным стеклом не образовались пузырьки воздуха. Края покровного стекла заливают расплавленным парафином, микроскопируют, используя люминесцентный микроскоп, оборудованный фазово-кон- трастным устройством. Вначале при фазовом контрасте считают общее число клеток в поле зрения (желательно, чтобы количество их было не больше 20—30), затем в УФ-спектре считают число светящихся клеток. Ободок клетки может светиться либо сплошной каемкой, либо пунктиром. Если светится вся клетка, то она мертва, ее в расчет не берут. Заметим, что на формваровой пленке таких клеток практически нет, мертвые клетки на ней не фиксируются.
Реакция торможения миграции лейкоцитов ставится с целью выявления лимфоцитов, сенсибилизированных к предполагаемому антигену. Если антиген является специфичным в данной ситуации, то диффузия лимфоцитов будет минимальной. Такая положительная проба свидетельствует о наличии фактора ингибиции.
Методика исследования. Необходимые материалы и оборудование: среда 199, 10% раствор желатина, 5% инактивированная сыворотка человека, 0,35% раствор NaOH, трис-буфер (pH 7,65), 0,4% раствор ЭДТА, центрифужные пробирки, центрифуга, термостат, пластмассовые капилляры длиной 7 мм и диаметром 0,6—0,7 мм.
Венозную кровь смешивают с антикоагулянтом ЭДТА (pH 7,4). Эритроциты осаждают 10% раствором желатина, добавленным к крови из расчета 1:9. После отстаивания и осаждения эритроцитов при комнатной температуре в течение 40 мин плазму, обогащенную лейкоцитами, осаждают центрифугированием при 1000 об/мин в течение 7 мин. Осадок лейкоцитов ресуспензируют в 0,5 мл среды 199 с 5% инактивированной сывороткой человека, добавив 4,5 мл смеси, состоящей из 9 частей 0,35% раствора NaOH и 1 части трис-буфера (pH 7,65), для растворения эритроцитов. Лейкоциты отмывают и снова ресуспензируют в среде 199, содержащей 5% человеческой инактивированной сыворотки и 0,4% ЭДТА, затем готовят густую лейкоцитарную взвесь, которой заполняют пластмассовые капилляры длиной 7 мм и диаметром 0,6—0,7 мм.
Капилляр, заполненный лейкоцитарной взвесью, прикрепляют на дно лунки глубиной 20 мм, диаметром 15 мм, которая затем заполняется средой 199 с добавлением антибиотиков (пенициллин со стрептомицином по 10 000 ЕД на 1 мл среды и 5% инактивированной прогреванием при 56° С в течение часа человеческой сыворотки); можно также использовать сыворотку лошади, кролика, осла и др.
Лунки диаметром 1,5 мм расположены в пластинке из органического стекла (4 ряда по 4 лунки). Заполненные средой и капиллярами с исследуемыми лимфоцитами лунки закрывают крышкой, края которой смазывают вазелином для герметизации. Всю систему помещают в термостат при 37° С. Учет реакции производят под лупой с малым увеличением. Микрометром, размеченным в окуляре, измеряют ширину и длину площади миграции лимфоцитов, которая вырисовывается под увеличением в виде своего рода «дерева», стволом которого является капилляр, а кроной — лимфоциты, располагающиеся вокруг капилляра.
Регистрацию можно проводить с помощью планиметра и рисовального аппарата. Показатель торможения миграции выражают в процентах по сравнению с контролем (сравнивается площадь миграции). Уменьшение площади миграции свидетельствует о наличии фактора, ингибирующего ее.
Модификация реакции торможения миграции лейкоцитов. Эту ре
акцию проводят не в капиллярах и лунках из органического стекла, а в лунках 1% агара, приготовленного на ‘/is М фосфатном буфере (pH 7,2). Взвесь лейкоцитов из периферической крови готовят, как описано выше. Лейкоцитарную взвесь помещают в лунки. Агар готовят по методике Манчини для диффузии иммуноглобулинов в агаре. Разогретый 1% агар «Дифко» на фосфатном буфере разливаются в чашки Петри высотой 8 мм. После остывания в нем делают лунки диаметром 0,6—0,8 мм. Искомый антиген или аллерген в этой модификации пробы размещают в агаре.
Цитотоксические тесты позволяют обнаруживать наличие иммунных и гетероиммунных антител. В педиатрической и акушерской клинике наибольшее значение имеет исследование изоиммунных антител при таких патологических состояниях, как лейкопения новорожденных, некоторые формы привычного недонашивания беременности и др. В основе такой патологии зачастую лежит несовместимость лейкоцитарных изоантигенов у матери и плода и как следствие — формирование у матери антител к изоантигенам плода. Такие антитела способны преодолевать плацентарный барьер и оказывать в той или иной мере повреждающее действие на развивающийся плод.
Лимфоцитотоксический тест. В основе этой реакции лежит повреждающее действие на клетку специфических антител в присутствии комплемента. Гибель лимфоцита устанавливается по его способности окрашиваться трипановым синим и другими красителями.
Источником лимфоцитов для постановки теста в клинической практике чаще всего служит периферическая кровь, хотя разработан метод получения лимфоцитов из грудного лимфатического протока. Выделение чистых лимфоцитов из периферической крови в клинических лабораториях чаще всего проводят в два этапа: вначале получают общую популяцию лейкоцитов путем добавления к гепаринизирован- ной крови высокомолекулярных соединений (декстран, желатин и т. д.) и затем дополнительно очищают лимфоциты от полинуклеаров на стеклянной и гигроскопической вате, нейлоне и т. д. Лучшим методом получения лимфоцитов является выделение их с помощью фикол-ве- рографинового градиента, как это было уже описано.
В пробирки или лунки пластин для титрования вносят по 0,2 мл разведений испытуемой сыворотки (цельная, ‘/2, lU и т. д.), добавляют по 0,1 мл взвеси лимфоцитов и инкубируют при 37° С 20—40 мин. Затем добавляют по 0,1 мл комплемента, пробирки встряхивают и вновь инкубируют в течение 30 мин. После инкубации вливают 2% раствор трипанового синего 4:1, каплю взвеси лимфоцитов помещают на предметное стекло, накрывают покровным стеклом и микроскопи- руют. Подсчитывают число окрашенных в синий цвет (неживых) и неокрашенных (живых) клеток. Реакцию оценивают в процентах неживых клеток для каждого разведения антисыворотки.
Реакция лейкоцитолиза при аллергической альтерации. Суть феномена аллергической альтерации состоит в том, что лейкоциты больного человека при контакте со специфическим
антигеном (аллегреном) в той или иной степени повреждаются. При этом отмечаются деформация клеток, фрагментирование, разрыв оболочки, выпадение гранул протоплазмы, пикноз, гипохроматоз и даже кариолизис. Реакция лейкоцитолиза (показатель повреждения нейтрофилов — ППН) оценивается в клинике как показатель сенсибилизации организма при аллергических процессах.
Методика исследования. В опытную пробирку берут 0,08 мл крови и добавляют 0,02 мл антигена, разведенного на цитрате натрия с таким расчетом, чтобы конечная концентрация последнего была 5%. В другую пробирку (контрольную) берут 0,08 мл крови и 0,02 мл 5% раствора цитрата натрия. Инкубируют при 38° С в течение 2 ч. Затем делают мазки, фиксируют их в метиловом спирте 3—5 мин и окрашивают по Романовскому — Гимзе. Подсчитывают количество поврежденных нейтрофилов в опыте и в контроле (Я0 — Як). ППН вычисляют по Н —Н
формуле:              °              к. Нормальное значение ППН до 0,01.