Определение уровня лизоцима в биологических жидкостях методом диффузии в агаре. Лизоцим — один из неспецифических факторов защиты организма от ряда патогенных бактерий и даже вирусов. Этот фермент вызывает повреждение мембран бактерий с последующей их гибелью, как самостоятельно, так и при взаимодействии с IgA.

1. Приготовление 0,1 М раствора бифталата калия. 20,42 г сухого бифталата калия растворяют в 1 л дистиллированной воды. Измеряют pH раствора на потенциометре. Обычно начальное pH буфера — 3,9—4. Для работы необходим буфер с pH 6,2. Доводят pH до нужного значения 10 н. раствором NaOH, а затем осторожно, по каплям, 1 н. раствором NaOH (до pH 6,2).
2. Приготовление агара. К 100 мл 0,1 М раствора фталатного буфера (pH 6,2) добавляют агар Дифко — 1г. Колбу с такой смесью ставят на водяную баню, и агар расплавляется. Хорошо растопленный раствор не должен опалесцировать. Затем агар вынимают из бани и охлаждают до температуры 45—50° С. Взвешивают нужное количество ацетонового порошка. На 100 мл жидкого агара берут 150 мг сухой культуры. Затем ее переносят в фарфоровую чашку и тщательно растирают. Буфера берут в 10 раз меньше, чем для приготовления жидкого агара. На 100 мл жидкого агара берут 10 мл 0,1 М бифталата калия с pH 6,2. Полученную суспензию вливают в 100 мл предварительно охлажденного агара, перемешивают и разливают по 15 мл в чашки Петри. Для лучшего застывания чашки с разлитым агаром ставят в холодильник на 30—40 мин. Затем в застывшем агаре делают лунки пробочным сверлом из нержавеющей стали диаметром 8 мм. Обычно
   делают 5 лунок: 3 — для контрольных растворов лизоцима, 2 — для исследуемых. В каждую лунку закапывают по 0,15 мл растворов. Затем чашку инкубируют 18—20 ч при 37° С. После этого измеряют зоны лизиса вокруг лунок и определяют концентрацию лизоцима в исследуемом растворе. Калибровочную кривую строят при помощи контрольных разведений лизоцима.
3. Приготовление контрольных растворов лизоцима из кристаллического порошка. 10 мг кристаллического порошка лизоцима осторожно пересыпают в мерную колбу емкостью 50 мл и вливают в нее дистиллированную воду до метки. Получают раствор лизоцима с концентрацией 200 мкг/мл. Этот рабочий раствор может долго храниться в холодильнике.

Для получения раствора концентрации 8 мкг/мл берут пипеткой 2 мл полученного рабочего раствора лизоцима, переносят его в сухую мерную колбу и вливают в нее до метки 50 мл дистиллированной воды. Получают раствор концентрации 8 мкг/мл. Для получения концентрации 1 мкг/мл берут 0,25 мл раствора с концентрацией 8 мкг/мл, переносят его в пробирку и добавляют 1,75 мл бифталата натрия; 2 мкг/мл — 0,5 мл лизоцима и 1,5 мл бифталата натрия; 4 мкг/мл — 1 мл лизоцима и 1 мл бифталата натрия.
Количественная характеристика классического и альтернативного путей активации комплемента. Комплемент (С) представляет собой систему белков нормальной сыворотки крови, активация которых играет важную биологическую роль в организме. Известно два основных способа активации системы С. Первым был открыт так называемый «классический путь», его инициирующим звеном является обычно комплекс антиген — антитело; второй — альтернативный, или пропер- диновый, путь с участием сывороточного белка пропердина.
В общем виде различия между классическим и альтернативным путями активации системы С касаются начальных этапов реакции. Конечная стадия в обоих случаях характеризуется формированием так называемого мембраноатакующего комплекса, обеспечивающего прямое цитолитическое действие на чужеродные клетки. Кроме того, система С в целом, а также ее фрагменты вызывают усиление фагоцитарной и лимфоцитарной активности и повышение проницаемости сосудов, стимулируя местные воспалительные реакции и способствуя, таким образом, противоинфекционной защите организма.
Методика исследования
Буферные растворы: VBS — 5,75 г веронала, 3 г мединала и 85 г натрия хлорида растворить в 1 л дистиллированной воды, pH 7,4; VBS2 : к 2 л VBS добавить 5 мл 1 М раствора MgCb и 1,5 мл

1. М раствора СаСЬ, pH 7,4; VBS-Mo-EGTA — к 100 мл 0,1 М EGTA (pH 7,4) добавить 50 мл 0,1 М раствора MgCb. К полученному раствору долить раствор VBS до 1 л, pH 7,4.

Примечание: 1) необходимую навеску EGTA растворить сначала в 10—15 мл раствора NaOH и долить дистиллированную воду до требуемого объема; 2) все буферные растворы перед работой разводить
дистиллированной водой в 5 раз; 3) в готовые буферные растворы перед работой добавить бычий сывороточный альбумин (1 г/л) для предотвращения спонтанного лизиса эритроцитов.
Раствор Олсвера: 24,6 г глюкозы, 9,6 г цитрата натрия и 5 г натрия хлорида растворить в 1200 мл дистиллированной воды; pH довести до 6,1 с помощью 1 н. раствора лимонной кислоты. Перед работой раствор стерилизуют.
Эритроциты кролика. Кровь берут из сердца, немедленно помещают в стерильный раствор Олсвера со стеклянными бусами и встряхивают сосуд 2—3 мин. Хранят при 4° С до 2 мес.
Перед использованием эритроциты центрифугируют со скоростью 1500 об/мин 5 мин, промывают 2—3 раза раствором VBS и 2 раза раствором VBS-Mg-EGTA.
Приготовление стандартной суспензии эритроцитов:

1. Осадок эритроцитов разводят в таком количестве раствора VBS- Mg-EGTA, чтобы при добавлении к 200 мкл суспензии 2800 мкл дистиллированной воды оптическая плотность лизата при 541 нм составила 0,7. Эту стандартную суспензию можно хранить 2—3 дня при 4° С.
2. Отбирают нужный для опыта объем стандартной суспензии, разбавляют его раствором VBS-Mg-EGTA в 3—4 раза и стандартизируют так, чтобы при добавлении к 200 мкл полученной суспензии 2800 мкл дистиллированной воды оптическая плотность лизата равнялась 1.

Эритроциты барана. Осадок эритроцитов барана трижды промывают в 5—10 объемах раствора VBS2+ и центрифугируют при 1500 об/мин по 5 мин. Полученный осадок ресуспендируют в 18 объемах раствора VBS2+ и стандартизируют описанным выше способом, доводя оптическую плотность лизата при 541 нм до 0,7. Полученную стандартную суспензию хранят 2—3 дня при 4° С.
Приготовление сенсибилизированных эритроцитов барана необходимо для образования комплексов АГ—АТ, инициирующих реакции классического пути активации системы С.
К 10 мл стандартной суспензии эритроцитов барана добавляют 10 мл гемолитической сыворотки, разбавленной в соотношении 1 : 400 раствором VBS2+. Сыворотку вливают в эритроциты. Все тщательно перемешивают и инкубируют 30 мин при 37° С, периодически помешивая. Центрифугируют со скоростью 1500 об/мин 5 мин. Сливают надосадок, разбивают клетки встряхиванием. Добавляют раствор VBS2+ (45 мл), перемешивают. Доводят оптическую плотность лизата при добавлении к 200 мкл суспензии 2800 мкл дистиллированной воды до 1 при 412 нм. Для постановки реакции используют плексигласовые панели с лунками объемом до 100 мкл.
Титрование С при классическом пути активации. В 10 лунок заливают по 25 мкл раствора VBS2+. В первую лунку добавляют 25 мкл исследуемой сыворотки и последовательно растит- ровывают ее по всем лункам. В каждую лунку добавляют по 20 мкл
суспензии эритроцитов барана (оптическую плотность проверяют непосредственно перед работой) и по 5 мкл VBS2+. Инкубируют 1 ч при 37° С. Контроль первый — эритроцитов: 200 мкл эритроцитов барана и 300 мкл VBS2+; второй — лизата: 200 мкл эритроцтов барана, 300 мкл VBS2+ и 2500 мкл Н2О.
Титрование С при альтернативном пути активации. В 7 лунок заливают 22 мкл раствора VBS-Mg-EGTA. В первую лунку добавляют 22 мкл исследуемой сыворотки и последовательно раститровывают по всем лункам. В каждую лунку доливают по 20 мкл эритроцитов кролика (оптическую плотность проверяют перед работой!) и 8 мкл раствора VBS-Mg-EGTA. Инкубируют 40 мин при 37° С. Контроль: первый — эритроцитов: 200 мкл эритроцитов кролика и 300 мкл раствора VBS-Mg-EGTA; второй — лизата: 200 мкл эритроцитов кролика, 300 мкл раствора VBS-Mg-EGTA и 2500 мкл НгО.
Оценка результатов. Титр комплемента определяют по содержимому последней лунки, в которой еще виден полный лизис; в качестве единицы измерения можно принять разведение сыворотки в этой лунке.
Функциональное состояние системы фагоцитирующих клеток. Фагоцитарная активность нейтрофилов. Важнейшей характеристикой функции гранулоцитов является оценка их фагоцитарной активности. Ее снижение может быть результатом как недостаточности опсониру- ющих факторов сыворотки (антител, комплемента), так и дефектов самих клеток (нарушения двигательной и метаболической активности врожденного или приобретенного характера). Для определения фагоцитарной активности используют стандартные штаммы непатогенных микроорганизмов (например, стафилококки штамма 209, убитые бактериям и, или аутофлора больного).
Методика определения фагоцитарной активности нейтрофилов (визуальный способ). Необходимые материалы и реактивы: микропипетки или пипетки для взятия крови на СОЭ; пробирки — стеклянные (лучше силиконизированные) или из пластика; предметные стекла; микроскоп с иммерсией; термостат; свежеприготовленный раствор 5% цитрата натрия; живая суточная культура микроорганизмов, например стафилококк — штамм 209; оптический стандарт мутности с образцами в 5, 10 и 20 ед., соответствующими 0,5-, 1- и 2-миллиардной взвеси микроорганизмов.
В пробирку, содержащую 0,1 мл 5% раствора цитрата натрия, вливают 0,2 мл капиллярной крови и добавляют 0,1 мл 2-миллиардной взвеси микроорганизмов. Инкубируют 30 мин при 37° С. Из взвеси клеток и микроорганизмов делают мазки, оставшуюся взвесь продолжают инкубировать еще в течение 1 ч и снова делают мазки. Мазки фиксируют смесью Никифорова и окрашивают по Романовскому— Гимзе. Под микроскопом просматривают 100 нейтрофилов, определяют количество поглощенных микробов.
Оценка фагоцитоза in vitro производится в соответствии с фазами реакции: через 30 мин и 2 ч. Поглотительная способность клеток
оценивается по двум показателям: процент фагоцитоза, количество фагоцитов на 100 нейтрофилов через 30 мин и 2 ч инкубации (в процентах), ФИ — среднее число микробов на 1 фагоцит через 30 мин и 2 ч инкубации. О последней фазе фагоцитоза — переваривании — судят по коэффициентам процента фагоцитоза и ФИ (отношение соответствующих показателей, изученных через 2 ч контакта, к тем же показателям через 30 мин). Фагоцитоз считается завершенным при коэффициентах менее 1.
Тест с нитротетразолиевым синим (НСТ-тест) используется для выявления так называемых активированных гранулоцитов и моноцитов. В основе активации фагоцитов лежит резкое усиление окислительных реакций. К числу индикаторов этого явления относится реакция с нитротетразолиевым синим: поглощенный из раствора, он под влиянием окислительных процессов в клетке превращается в нерастворимый формазан. Последний определяется в клетке в виде темно-синих гранул.
Различают спонтанный и стимулированный НСТ-тест. Результаты спонтанного теста указывают на количество активированных клеток в крови больного, например под влиянием инфекции. Результаты стимулированного теста дают представление о способности исследуемых нейтрофилов к активации in vitro. Этот тест следует проводить при сниженном числе спонтанных НСТ-положительных клеток у больных с бактериальной инфекцией, чтобы выявить наличие или отсутствие дефекта окислительного метаболизма.
Методика исследования. Необходимые реактивы и материалы: КН2РО4, Na2HPCgt;4, глюкоза, NaCl, нитротетразолиевый синий, гепарин, метиловый спирт, 1% водный раствор метиленового зеленого (в случае загрязнения синей краской необходимо промывание хлороформом через делительную воронку), микропипетки, предметные стекла, микроскоп с иммерсией.
Приготовление раствора:
А. 1% 15 М фосфатного буфера с pH 7,2 с добавлением 0,2% раствора глюкозы и 0,6% раствора натрия хлорида (к 25 мл 1/15 М КН2РО4 добавляют 36 мл 1/15 М раствора Na2HPCgt;4; на 61 мл буфера нужно 120 мг глюкозы и 370 мг NaCl).
Б. 0,1% нитротетразолиевый синий в изотоническом растворе натрия хлорида. Для получения красителя необходимы длительное перемешивание и подогревание в горячей воде.
Растворы А и Б фильтруют через бумажные фильтры и хранят в холодильнике при температуре 10° С в течение 2—4 нед. Непосредственно перед постановкой теста смешивают равные количества растворов А и Б, смесь нагревают до 30—37° С. Кровь из пальца больного берут пипеткой, промытой гепарином. В центрифужной или пластиковой пробирке смешивают по 0,1 мл гепаринизированной крови и подогретой смеси. Инкубация 25 мин в термостате при 37° С, затем 10 мин при комнатной температуре. Из верхнего слоя клеточного осадка готовят мазки, высушивают их на воздухе 3—5 мин, фиксируют
метиловым спиртом, затем окрашивают метиленовым зеленым в течение 10 мин. Препараты просматривают под микроскопом с иммерсией.
Постановка стимулированного НСТ-теста. Гепа- ринизированную кровь предварительно инкубируют 25 мин при 37° С со стимулятором (например, 2-миллиардной взвесью стафилококка — штамм 209, надосадочной жидкостью, содержащей лимфокины и др.) в равных объемах. Затем проводят вышеописанный НСТ-тест.
Метод «кожное окно» — локального воспаления (тест Ребука) используют для оценки течения воспалительной реакции, а также хемотаксической активности нейтрофилов и моноцитов in vitro.
В первые часы повреждения кожи на раневой поверхности появляются главным образом нейтрофилы, после 10—12 ч преобладают моноциты, после 28—32 ч — фибробласты; наблюдается появление волокнистых структур.
Изменение течения воспалительной реакции состоит прежде всего в уменьшении выхода клеточных элементов в одних случаях вследствие снижения хемотаксической активности, в других — вследствие перераспределительных механизмов, когда очаг воспаления в самом организме является доминирующим и оказывает более сильное хемотрактантное действие, чем кожная ранка.
Имеют значение и такие признаки, как пикноз ядер нейтрофилов в 1-й фазе реакции, указывающий на высокую повреждаемость этих клеток (характерно для острых и хронических гнойных процессов), резкая вакуолизация цитоплазмы моноцитов в той же фазе (характерно для «болезней накопления»), наличие волокнистых структур и фиб- робластов в 1—2-й фазах (характерно для фибропластических процессов).
Проведение повторных тестов позволяет судить о динамике воспалительного процесса, ответа на терапию.
Методика исследования. Необходимые материалы: предметные стекла 2 * 2 см с отшлифованными краями, лейкопластырь, скарификатор, этиловый и метиловый спирт, 0,1% водный раствор азура-И и эозина.
На коже передней поверхности предплечья, предварительно обработанной этиловым спиртом, снимают скарификатором слой эпидермиса 0,5 х 1 см. Ранку покрывают стерильным стеклом, которое укрепляют лейкопластырем. Через 6 ч это стекло заменяют другим. Последнее снимают через 24 ч от начала постановки теста. Ранку обрабатывают спиртом. Полученные препараты (отпечатки) высушивают на воздухе, фиксируют в течение 5—10 мин метиловым спиртом и окрашивают по Романовскому—Гимзе. Под микроскопом с иммерсией подсчитывают не менее 2000 клеток, определяют процентное соотношение клеточных элементов, описывают морфологические особенности клеток (сохранность в препарате, дегенеративные изменения ядер, наличие фагоцитированных частиц, вакуолизация цитоплазмы, псевдоподии), учитывая наличие или отсутствие волокнистых структур.
Оценка результатов: в норме в препаратах, полученных через 6 ч,
нейтрофилы составляют 83,5 ± 6,05%, макрофаги — 15,0 ± 4,8%, эози- нофилы — 1,5 ± 0,4%, лимфоциты, базофилы и волокнистые структуры не определяются — это первая, нейтрофильная, фаза воспалительной реакции. В препаратах, полученных через 24 ч, нейтрофилы составляют 15,8 ± 4,5%, макрофаги — 84,2 ± 8,3%, эозинофилы — менее 0,5%, лимфоциты — единичны, базофилы не определяются. У некоторых детей встречаются фибробласты и волокнистые структуры в виде единичных элементов. Это вторая, макрофагальная, фаза воспалительной реакции.