Представленные выше экспериментально установленные факты позволяют сделать основное заключение о том, что аллогенное подавление проявляется всегда, когда между донорскими клетками и хозяином имеются генетические различия. Восстановление генетической идентичности, в частности путем создания адекватного клеточного микроокружения, приводит к нормальному развитию трансплантируемых клеток или тканей. Особое значение в явлении аллогенной ингибиции принадлежит антигенам гистосовместимости.
Как уже отмечалось, в работах по отмене аллогенного подавления колониеобразующей способности клеток костного мозга проводилось искусственное воздействие на организм реципиента —создание генетически адекватного трансплантируемым клеткам микроокружения. Нами выбран иной путь — путь специфического воздействия на клетки донора.
Планируя собственные эксперименты, мы исходили из того, что инкубация клеток (первого родителя) с РНК от аллогенного донора (второго родителя) или от гибридного реципиента определит формирование на поверхности культивируемых клеток антигенных структур, свойственных донору РНК. Подобная антигенная модификация аллогенных клеток, по предположению, должна отменить фенотипические различия между донором клеток и реципиентом и довести результат межклеточных взаимодействий при колониеобразовании до уровня, свойственного сингенным системам.
Для решения основной задачи исследования использовали различные классы РНК, выделенные методом фенольно-термического фракционирования с использованием диэтилпирокарбо- ната — неспецифического ингибитора нуклеаз. Изучены следую- 298
щие классы РНК: класс цитоплазматических РНК (температурная фракция 0-4 °С), класс пре-рРНК и рРНК ( фракция 40 °С), класс РНК, содержащий смесь пре-рРНК и пре-мРНК (фракция 55 °С), класс ДНК-подобной пре-мРНК (фракция 63 °С) и класс трудноэкстрагируемых пре-мРНК ядра (фракция 85 °С). Каждая фракция охарактеризована по содержанию остаточного белка, нуклеотидному составу и полимерным свойствам при анализе препаратов по электрофоретической подвижности в полиакриламидном геле и по коэффициенту седиментации в градиенте плотности сахарозы. В работе использовали только те фракции, которые имели высокополимерный молекулярный состав и были лишены спектрофотометрически выявляемого белка.
Во всех случаях независимо от конкретных задач исследования проводили инкубацию анализируемых клеток с одним из классов РНК в течение 30 мин при 37 °С. Проинкубированные клетки вводили сингенным или аллогенным реципиентам.
В таблице 11.2 представлены данные по числу КОЕ в селезенке мышей F|, которым вводили либо интактные клетки костного мозга, либо обработанные тотальной РНК, выделенной из селезенки родителей или их гибридов. Видно, что число КОЕ снижено, если реципиентам Fi трансплантировали клетки костного мозга от родителей СВА. Колониеобразование не подавлялось, коща использовали клетки костного мозга от мышей DBA/2. Результаты этой части опытов послужили основой для анализа влияния РНК на колониеобразующую способность клеток костного мозга линии мышей, подвергающихся аллогенной инги- биции.
Таблица 11.2
Влияние РНК на число колониеобразукнцих единиц (КОЕ),
формируемое клетками костного мозга родителей
в гибриде первого поколения
Предварительная инкубация клеток костного мозга мышей линии СВА с “сингенной” РНК (РНК из селезенки СВА) не приводит к восстановлению колониеобразования. При инкубации клеток костного мозга мышей той же линии с РНК из селезенки второго родителя (DBA/2) или гибрида F] число КОЕ восстанавливается. В то же время РНК, выделенная из селезенки линии мышей, отличающейся по Н-2-комплексу от родительских линий (CC57W — Н-2Ь), оказывается инертной в эффекте отмены аллогенной ингибиции. Представленные факты говорят в пользу линейной специфичности действия РНК. При работе с другим гибридом — (CBAxC57BL/6J)F| — получены аналогичные результаты.
Работа с тотальным препаратом РНК дает представление о принципиальной возможности отмены аллогенной ингибиции с помощью РНК “линейной специфичности”, но затрудняет трактовку полученных данных.
В следующей серии экспериментов была проведена работа с различными классами РНК. Как показывает рис. 11.3, наибольшей активностью в отмене аллогенной ингибиции обладает класс пре- мРНКяцра (фракция 63вС), полученной от реципиента. Дополнительное подтверждение специфичности наблюдаемой отмены ал-
Рис 11.3. Отмена аллогенной ингибиции колониеобразования с помощью РНК реципиента.
Показано число колониеобразующих единиц (КОЕ) у гибрида (CBAxC57BL/ 6J)Fjt которому вводили клетки родительского костного мозга C57BL/6J, проинкубированные с различными фракциями РНК от (CBAxC57BL/6J)F|, Контроль: верхняя заштрихованная полоса — трансплантация интактных клеток костного мозга от Fi-»Fi, нижняя — C57BL/6J-»F|. По горизонтали отмечено количество РНК (мкг), использованное для инкубации с 3-10® клеток. Видно, что наибольшей активностью в отмене аллогенной ингибиции обладает класс пре-м-PH К ядра (63°С фракция)
логенной ингибиции дают сравнительнь[е опыты с пре-мРНК, полученной от линии донора (C57BL) и реципиента (СВАх C57BL)Fi (рис. 11.4). Видно, что инкубация клеток костного мозга мышей линии C567BL/6J с различными классами РНК, выделенными из селезенки мышей той же линии, не обеспечивает какого-либо восстановления аллогенного подавления. Ни один из классов РНК донорского типа не способен определить нормализацию колониеобразования в гибридном организме. Восстанавливающий эффект различных классов РНК реципиента (Fi) аналогичен тому, который представлен на предыдущем рисунке.
Планируя последующие эксперименты, мы исходили из тех представлений, что в рассмотренном выше феномене отмены аллогенного барьера имеет место общий механизм, который определен матричной активностью РНК определенного генотипа. Вероятно, "линейная специфичность” действия экзогенной РНК связана с модификацией клеточной поверхности через появление структур (Н-2-антигенов) того генотипа, который послужил источником РНК. В пользу подобного предположения говорят и те эксперименты, которые выявили наибольшую активность класса пре-мРНК ядра в фенотипической модификации клеточных отношений.
Для подтверждения высказанной точки зрения были поставлены опыты in vitro с целью прямого наблюдения за возникнове-
Рис. 11.4. Сравнительные данные по способности клеток костного мозга родительской линии, проинкубированных с РНК донора н гибридного реципиента, формировать колонии в условиях аллогенной ингибиции.
Показано число колониеобразуюших единиц (КОЕ) у гибрида (CBAxC57BL/ 6J)F|, которому вводили родительские клетки костного мозга C57BL/6J, проинкубированные с различными фракциями РНК от C57BL/6J (1) или (CBAxC57BL/ 6J)Fi (2). Инкубация клеток костного мозга родительской линии с различными классами РНК, выделенной из селезенки мышей той же родительской линии, не приводит к какому-либо восстановлению колониеобразования у гибридного реципиента. В то же время пре-мРНК гибрида, как и в предыдущем опыте, полностью восстанавливает колонисобразование в условиях аллогенной ингибиции
нием специфических антигенов, соответствующих донору РНК. Работу проводили с клетками перитонеального экссудата мышей линий СВА и C57BL/6J, различными классами РНК мышей этих же линий и антисыворотками: СВА aH*ra-C57BL/6J и C57BL/6J анти-СВА.
Внесение в монослойную культуру макрофагов пре-мРНК аллогенного донора приводит к появлению через 48 часов культивирования антигенов донора РНК, что оценивается с помощью соответствующей цитотоксической антисыворотки (рис. 11.5). Возникновение аллоантигенов донора РНК связано с высокополимерной пре-мРНК, так как использование препарата, выделенного в отсутствие диэтилпирокарбоната и характеризующегося преимущественным содержанием низкомолекулярных фрагментов, не обеспечивает серологической модификации культивируемых клеток. Экспрессия антигенов донора РНК характеризуется определенной динамикой. Пик выхода антигенов наблюдается через 48 часов после внесения РНК в культуру ( рис. 11.6). Наибольшей антигенсинтезирующей активностью обладает класс пре-мРНК, определенная активность наблюдается у суммарной фракции цитоплазматической РНК. Класс рибосомальной РНК не проявлял какой-либо активности (рис. 11.7). Основные антигены, экспрессирующиеся при внесении аллогенной РНК, относятся к антигенам Н-2-комплекса (рис. 11.8). Возникновение Н-2-антигенов на
Рис. 11.5. Экспрессия антигенов гистосовместимости донора РНК на культивируемых клетках.
Экспрсссию антигенов на культивируемых клетках оценивали по цитотоксическому тексту с антисывороткой к антигенам донора РНК. В опытах использована монослойная культура макрофагов СВА, в которую добавляли пре-мРНК мышей линии C57BL/6J, и антисыворотка против антигенов C57BL/6J (СВА анти- C57BL/6J). Добавление в культуру макрофагов пре-мРНК C57BL/6J приводит к появлению на поверхности культивирумых клеток антигенов донора РНК, что оценивали по проценту гибели клеток в цитотоксическом тесте с антисывороткой к антигенам донора РНК (I). РНК, выделенная в отсутствие ДЭП, неактивна (II). Линия III — процент мертвых клеток (МК) в интактной культуре
поверхности культивируемых клеток есть результат активного белкового синтеза de novo, о чем говорят опыты с использованием ингибитора белкового синтеза — циклогексимида (рис. 11.9).
Подводя итог представленным экспериментальным данным, следует обратить внимание на три основные фуппы фактов.
- Установление “линейной специфичности” действия РНК: в отмене аллогенной ингибиции колониеобразования активна только РНК гибрида или РНК второго родителя в системе переноса родитель — гибрид.
Рис. 11.7. Акпввость различных классов при экспрессии аллогенных антигенов гистосовместимости ня культивируемых клетках.
Различные классы РНК выделяли от мышей линии СВА, которые затем культивировали с макрофагами линии C57BL/6J. Уровень экспрессии антигенов гистосовместимости оценивали по числу мертвых клеток, определяемых в цитотоксическом тесте с антисывороткой C57BL/6J-aHTH-CBA. Культуры: А - без РНК (контроль); I — фракция 40 °С; II — фракция 63 °С; III — фракция 0-4 °С
- Среди различных классов РНК полноценной активностью в отмене дефекта взаимодействия несингенных клеток обладает класс пре-мРНК ядра.
- Активность данного класса проявляется в формировании на поверхности культивируемых с РНК клеток Н-2-антигенов, свойственных донору РНК.
Таким образом, следует заключить, что фенотипическая коррекция клеточных взаимодействий в системе колониеобразования связана с антигенной модификацией клеток, вступающих в кооперативные отношения со стромальными элементами хозяина, “сингенизациеЙ” отношений донор-реципиент.
В суммарном виде полученные результаты отражает рис. 11.10.
Рис. 11.8. Доминирующая экспрессия па поверхности жулътивирумых клеток антигенов комплекса Н-2, соответствующих донору пре-мРНК.
Использована монослойная культура макрофагов мышей линии C57BL/6J, пре-мРНК мышей линии СВА и антисыворотка C57BL/6J анти-СВА, адсорбированная клетками мышей линии СЗН. Мыши линий СВА и СЗН имеют общий Н-2-гап- лотнп. А — культура без РНК (контроль): I — культура с РНК; II — культура с РНК + антисыворотка C57BL/6J анти-СВА, адсорбированная клетками селезенки мышей линии СЗН. Видно, что антисыворотки, из которых удалены антитела к Н-2-анти генам, неспособна обнаружить соответствующие антигены на поверхности культивированных с РНК клеток (II)
Рис. 11.9. Подавление экспрессии антигенов гистосовместимости с помощью ингибитора белкового синтеза циклогексимнда.
Внесение в культуру макрофагов C57BL/6J, культивируемых с пре-мРНК мышей линии СВА, увеличивающейся дозы циклогексимнда (Or 1 до 5 мкг на культуру) подавляет экспрессию антигене» донора РНК. (H-IV). Оценку проводили с помощью антисыворотки C57BL/6J анти-СВ А, подсчитывая процент мертвых клеток. I — культура без циклогексимида (контроль)
Рис. 11.10. Суммирование результатов опытов по отмене с помощью РНК аллогенной ингибиции колониесбразоamp;ання.
Верхняя часть рисунка — схема постановки опытов. А, В, и (AxB)F| — родители и гибрид соответственно. Использованы различные классы РНК, выделенные из селезенки мышей определенных генотипов: тот. РНК — суммарная РНК селезенки; цит. РНК — цитоплазматическая РНК; пре-рРНК — предшественник рибосомальной РНК; пре-мРНК — предшественник матричной РНК. 1. Введение клеток костного мозга (КМ) гибридов (AxB)Fj сингенному реципиенту (AxB)Ft приводит к образованию определенного числа колоний (колонисобразующих единиц — КОЕ) на строме, опустошенной после облучения селезенки. 2. Такое же введение клеток КМ одного из родителей (А) приводит к резкому снижению числа КОЕ (констатация аллогенной ингибиции). 3, 4. Предварительная инкубация клеток КМ донора А с тот. РНК от второго родителя В или гибрида (AxB)F| восстанавливает колониеобразование (эффект отмены аллогенной ингибиции). 5,6. Суммарная (тот.) РНК донора клеток КМ, как и донора неродственного генотипа (С), неспособна восстановить колониеобразование. 7. Цитоплазматическая (цит.) РНК реципиента обладает умеренной активностью по восстановлению колонис- образования. 8. Пре-рРНК реципиента нс способна обеспечить восстановление ко- лонисобразования. 9. Пре-мРНК полностью восстанавливает колониеобразование.
