MED24INfO

  Метод проточной цитофлуориметрии, предложенный в начале 1970-х годов, широко используется в медико-биологических и клинических исследованиях. Востребованность цитометрии объясняется быстротой, точностью и надежностью метода. Определение фенотипа каждой клетки в сочетании с анализом большого количества событий дает максимально полную информацию в кратчайшие сроки.
Принцип метода. Используются проточные цитометры разных фирм. При проведении исследования клетки, окрашенные тем или иным флуоресцентным красителем, вводят с потоком буферного раствора в вибрирующую проточную камеру с форсункой. В каждой капле жидкости, выходящей из форсунки, содержится одна клетка. Источник света (чаще всего лазер) освещает отдельные клетки в проходящей через световой пучок тонкой струе жидкости. Исходный световой луч рассеивается клеткой. Это рассеяние измеряется с помощью фотоэлектронного умножителя (ФЭУ). Рассеяние света под малыми углами (переднее рассеяние — forward scatter) может быть использовано для определения размеров клетки. На основе данного параме

тра можно отличить жизнеспособные ядерные клетки от мертвых и эритроцитов. Рассеяние света под углом 90° (боковое рассеяние — side scatter) позволяет судить о соотношении размеров ядра и цитоплазмы и наличии гранул в клетке. Полученные характеристики позволяют разделить анализируемые лейкоциты на лимфоциты, моноциты, нейтрофилы. Одновременно можно проводить анализ поверхностных и внутриклеточных антигенов клеток с помощью моноклональных антител к ним, конъюгированных с различными флуоресцентными метками. Если анализируемая клетка содержит флуорохром, то он испускает излучение соответствующих параметров, при этом интенсивность флуоресценции коррелирует с плотностью антигена на клеточной поверхности, а уровень флуоресценции измеряется с помощью ФЭУ (рис. 2.4, см. также цв. вклейку).
В практике широко используются два флуоресцентных красителя — флуоресцеин-5-изотиоционат (ФИТЦ) и R-фикоэритрин (ФЭ). Они возбуждаются аргоновым лазером с длиной волны 488 нм и излучают флуоресценцию в разных диапазонах волн: ФИТЦ излучает свет в «зеленом» спектре, а ФЭ — в «оранжево-красном». Красители различаются как по специфичности их молекулярного связывания, так и по оптическим характеристикам, таким, как спектр поглощения, возбуждение флуоресценции и др. В настоящее время спектр используемых флуорохромов расширился (табл. 2.1).
Таблица 2.1. Основные используемые флуорохромы

No	Название флуорохрома	Цвет испускаемой флуоресценции	Длина волны лазеров, нм	Спектр излучения, нм
1	Alexa Fluor 405	Синий	360, 405, 407	421
2	Pacific Blue	Голубой	360, 405, 407	455
3	AmCyan	Зеленый	405, 407	491
4	Alexa Fluor 488	Зеленый	488	519
5	FITC	Зеленый	488	519
6	PE	Желтый	488, 532	578
7	PE-Texas Red	Оранжевый	488, 532	615

Окончание табл. 2.1

№	Название флуорохрома	Цвет испускаемой флуоресценции	Длина волны лазеров, нм	Спектр излучения, нм
8	Texas Red	Оранжевый	595	615
9	АРС	Красный	595,633, 635, 647	660
10	Alexa Fluor 647	Красный	595, 633, 635, 647	668
11	РЕ-Су5	Красный	488, 532	667
12	PerCP	Красный	488,532	678
13	PerCP-Cy5.5	Насыщенный красный	488, 532	695
14	Alexa Fluor 700	Насыщенный красный	633, 635	719
15	PE-Cy7	Инфракрасный	488, 532	785
16	APC-Cy7	Инфракрасный	595, 633, 635, 647	785
17	BD АРС-Н7	Инфракрасный	595, 633, 635, 647	785
Флуорохромы, связывающиеся с ДНК
Бромистый этидий			518	610
Пропидиум иодид			540	625

Проточный цитометр включает три основных блока:

1. оптический, где производится измерение;
2. блок обработки сигналов, где сигналы усиливаются и преобразуются в электрические;
3. блок сбора и обработки данных (см. рис. 2.4).

Оптические системы
Источником света обычно служит лазер. Он способен направить на клетку интенсивный световой сигнал и создать чувствительную систему детекции.
Световой сигнал проходит через соответствующие линзы и зеркала и попадает на ФЭУ. На этой стадии передачи сигнала используются

оптические фильтры для выделения света с определенной длиной волны, благодаря чему на каждый детектор попадает только избранный тип светового сигнала, например зеленое или красное излучение клеток при флуоресценции или рассеянный свет. Оптический блок предназначен для измерения рассеяния света и флуоресценции. Современные цитометры оборудованы несколькими фотоэлектронными умножителями, что позволяет одновременно регистрировать несколько типов флуоресценции.

Рис. 2.4. Устройство проточного цитометра