В основе комплекса методов, предназначенных для оценки состояния адаптивного иммунитета, лежит определение реализующих его клеток. Для этого используют методы проточной цитометрии. Общепринято использование с этой целью антител к маркерным антигенам, меченых флуорохромами. Суммарную популяцию Т-лимфоцитов тестируют с помощью моноклональных антител к СD3, а 2 их основные субпопуляции — с помощью антител к CD4 и CD8. Поскольку молекула CD3 — абсолютный маркер Т-лимфоцитов, то при определении CD4+ и CD8+ Т-клеток их параллельно окрашивают моноклональными антителами к CD3, так как молекулы CD4 и CD8 могут экспрессироваться не только Т-лимфоцитами. При этом применяют окрашивание антителами, мечеными контрастными флу- орохромами (например, зеленым, оранжевым или розовым). Для выявления В-лимфоцитов довольствуются использованием антител к CD19 — молекуле, присутствующей на всех В-клетках и только на них. Антитела к тяжелым и легким цепям иммуноглобулинов используют редко, поскольку ни одна из разновидностей цепей не присутствует на всех В-клетках. Определение мембранных к- и ^-цепей используют для оценки моноклональности В-лимфоцитов при лимфопролиферативных процессах.
В лабораторной практике функцию лимфоцитов оценивают редко, хотя, строго говоря, функциональные показатели важнее, чем показатели численности клеток. Игнорирование функциональной активности лифмоци- тов связано с техническими проблемами, возникающими при постановке функциональных тестов, с их громоздкостью, трудоемкостью и дороговизной. Адекватный подход к суммарной оценке функционального потенциала (а не конкретной функции) — методы измерения пролиферативного ответа лимфоцитов (в основном Т-клеток) на митогенную стимуляцию. В качестве митогенов раньше использовали растительные митогенные лектины — фитогемагглютинин, реже конканавалин А, в настоящее время — активирующие моноклональные антитела к CD3 (оптимально — анти- CD3-антитела, фиксированные на пластике, в сочетании с растворимыми антителами к костимулирующей молекуле CD28). Все перечисленные мито- гены вызывают поликлональный митогенный ответ, который поддается достаточно точному измерению в отличие от олигоклонального ответа на конкретные антигены, интенсивность которого обычно ниже чувствительности используемых методов.
Пролиферацию чаще всего количественно оценивают по включению 3Н-тимидина. Несмотря на неудобства, обусловленные использованием радионуклида, этот метод остается эталонным благодаря высокой чувствительности, способности выявлять достаточно тонкие изменения измеряемого показателя. Существует несколько альтернативных подходов, основанных на использовании проточной цитометрии, наиболее интересен из которых тест на разбавление флуоресецентной метки CFSE (Carboxyfluorescein succinyl ester). Этот флуорохром связывается с внутриклеточными белками клетки, не нарушая ее жизнеспособности и функциональной активности, и при делении в равных количествах переходит в дочерние клетки. При проточной цитометрии выявляют распределение меченых клеток в виде нескольких пиков, из которых правый (с максимальным содержанием красителя) соответствует неделившимся клеткам, а следующие за ним справа налево пики отражают численность клеток, делившихся 1, 2, 3 раза и т.д. Помимо возможности измерения числа клеток, прошедших определенное число делений, при условии выявления различных маркеров можно допол-
нительно охарактеризовать свойства клеток в каждом пике. Более простой цитофлуорометрический подход дает возможность суммарно определить долю клеток, находящихся в цикле, измеряя процент клеток с гипердиплоидным содержанием ДНК; для этого клетки окрашивают флуоресцентным красителем, связывающимся с ДНК — пропидия йодидом. Использование специально разработанных программ позволяет определить число клеток, находящихся в фазах цикла G1+S, G2, а также в митозе.
Иногда возникает необходимость оценить процент клеток, вступающих в апоптоз (что с определенной натяжкой также можно рассматривать как функциональную характеристику клеток). С этой целью используют вышеописанный цитофлуорометрический подход с окрашиванием клеток пропи- дия йодидом. Однако при этом определяют число клеток в гиподиплоидном пике, расположенном левее диплоидного (при апоптозе теряется часть ядерного материала, содержащего ДНК). Другой метод цитофлуорометрической оценки апоптоза состоит в определении связывания аннексина V, меченого флуорохромом. Этот реагент специфически взаимодействует с фосфатидил- серином, который появляется на поверхности клетки только при апоптозе.
К функциональным тестам, позволяющим в определенной степени охарактеризовать реактивность клеточных клонов, относят тест торможения миграции лейкоцитов. Он основан на быстрой (после 20—30-минутной инкубации) регистрации in vitro ослабления миграции из капилляров лейкоцитов крови человека под влиянием комплекса цитокинов, секретиру- емых лимфоцитами или иными клетками. К достоинствам этого метода относят его чувствительность, быстроту выполнения и возможность стандартизации.
Оценка функциональной активности субпопуляций Т-лимфоцитов обычно не входит в программу лабораторного обследования больных. В особых случаях, когда подобная задача возникает, функцию Т-хелперов определяют по способности продуцировать цитокины. Для дифференцирования Th1- и ТИ2-клеток исследуемую популяцию лимфоцитов стимулируют сочетанным действием форболмиристат ацетата (неспецифический активатор протеинкиназы С) и иономицина (кальциевый ионофор), что обеспечивает ускоренную активацию клеток в обход антигенраспознающих рецепторов. Клетки обрабатывают брефелдином А, блокирующим внутриклеточный транспорт молекул с участием аппарата Гольджи (включая процесс секреции) с целью сохранения внутри клетки синтезируемых молекул. Затем нарушают целостность клеточной мембраны путем обработки сапонином и инкубируют клетки с моноклональными антителами к цитокинам, меченым флуорохромом, после чего проводят проточную цитометрию. Обычно в клетках выявляют синтез ключевых цитокинов Th1- и ^2-клеток — соответственно IFNy и IL-4.
Чаще, особенно зарубежные специалисты, оценивают секрецию Thl-клетками IFNy с использованием метода ELISPOT (Enzyme-linked immunospot). В этом случае клетки инкубируют на нитроцеллюлозной мембране, сенсибилизированной антителами к IFNy (или другому определяемому цитокину — в зависимости от задач исследования) в присутствии стимулятора и затем с помощью иммуноферментного метода определяют фиксацию секретированного цитокина на нитроцеллюлозной мембране (секертируемый IFNy связывается с фиксированными антителами и может быть обнаружен с помощью вторых антител, меченых пероксидазой). Число окрашенных пятен, соответствующих клеткам, секретирующим цитокин, подсчитывают с помощью специального прибора или под микроскопом. Этот метод широко используют также для отбора Т-клеточных эпитопов при создании вакцин.
Функцию цитотоксических Т-лимфоцитов определяют с помощью тех же подходов, которые используют для фукнциональной оценки NK-клеток. Однако получение данных сильно осложняется, во-первых, необходимостью предварительной индукции активности этих клеток в смешанной культуре лейкоцитов, а во-вторых, очень малой частотой антигенспецифических Т-клеток в популяции. В рутинной лабораторной практике определение этих клеток не проводят.
В арсенале методов лабораторной оценки адаптивного звена иммунной системы отсутствуют тесты на состояние специфического гуморального иммунитета, хотя теоретически антителообразующую способность клеток В-ряда можно оценивать с использованием ELISPOT. Однако для индукции антителообразования in vitro необходимы усилия, трудновыполнимые даже при научных исследованиях. Именно поэтому подходы к оценке состояния гуморального иммунитета ограничиваются определением концентрации иммуноглобулинов основных классов, для чего используют иммуноферментный метод. Менее предпочтителен используемый до сих пор метод радиальной иммунодиффузии, основанный на оценке диаметра кольца преципитации, формирующегося при диффузии исследуемых белков в агар, содержащий антитела к определяемому иммуноглобулину. Реже определяют естественные антитела к распространенным бактериальным антигенам и маркерам групп крови. Для выявления пролиферативного потенциала В-лимфоцитов оценивают их пролиферативный ответ на действие митогена лаконоса — растительного лектина, вызывающего Т-зависимую поликлональную пролиферацию В-клеток.
Тесты in vivo практически не используют при лабораторной иммунодиагностике в связи с их инвазивностью. Следует назвать лишь пробы с внутрикожным введением комплекса распространенных антигенов (кандидозный антиген, стрептокиназа-стрептодорназа, туберкулин и другие антигены; в качестве варианта вводят митогены или гаптены, например, динитрохлорбензол). Результаты тестирования оценивают по интенсивности воспалительной реакции, развивающиеся в местах введения. Такие тесты информативны, поскольку адекватно отражают функциональное состояние популяции Т-лимфоцитов (например, при первичных иммунодефицитах) и коррелируют с исходом некоторых патологических процессов, в том числе опухолевых. Тем не менее в связи с инвазивным характером воздействия эти подходы используют достаточно редко.
Резюмируя краткий обзор арсенала методов иммунодиагностики, подчеркнем его ограниченность и несопоставимость по степени информативности и однозначности при трактовке результатов с методами диагностики, сложившимися в других областях медицины. Ситуацию усугубляет часто неадекватная трактовка результатов иммунологического обследования, обусловленная ограниченностью иммунологических знаний во врачебной среде.