Конструирование тетрамерных комплексов МНС класса I обеспечило создание быстрого, специфичного и высокочувствительного метода выявления и подсчета антигенспецифических CD8+ Т-клеток с помощью проточной цитофлуориметрии. Тетрамер состоит из молекул МНС класса I, нагруженных специфическим антигенным пептидом, связанных с биотином, которые затем прикрепляются к стреп- тавидину, меченному флуорохромом — ФИТЦ, ФЭ и др. (рис. 3.1, см. также цв. вклейку). Тетрамеры МНС класса I связываются с CD8+ субпопуляцией Т-лимфоцитов. Созданы тетрамеры МНС класса II, связывающиеся с CD4+ Т-лимфоцитами. Тетрамерные структуры характеризуются сниженной способностью связывания с молекулой CD8. Однако сохраняют способность специфически связываться с ТКР, обеспечивая точное узнавание антигенспецифических Т-клеток. Количество выявляемых данным методом антигенспецифических клеток составляет менее 1% от всех С08+-клеток.
Отдельное использование тетрамерного связывания не дает информации о фенотипе клеток или функции ЦТЛ, поэтому целесообразно параллельно проводить определение внутриклеточного содержания цитокинов, хемокинов и цитотоксических эффекторных молекул (перфорина, гранзимов), фенотипа специфических CD8+ Т-лимфоцитов.
Рис. 3.1. Тетрамерные структуры: а — строение тетрамерной структуры; б — связывание тетрамера ЦТЛ; в — пример результатов, полученных при анализе тетрамерных структур на проточном цитофлуориметре; ФИТЦ — флуоресцеин-5-изотиоционат; ФЭ — фикоэритрин
Использование методов цитофлуориметрического определения цитотоксической активности в комбинации с тетрамерным методом и иммунофенотипированием позволяет полно охарактеризовать популяции КЭ (ЦТЛ) и КМ. Данные методы — мощный инструмент для изучения кинетики киллерной активности ЦТЛ, они дают представление о фенотипе клеток и позволяют отслеживать физиологические изменения в КЭ и КМ