Химико-спектральный метод. Этот метод используется для определения гаптенов — никеля, хрома, кобальта и микропримесей железа, меди, марганца, серебра, палладия, кадмия в биологической среде (слюна человека). Он дает возможность группового определения микроэлементов. Чувствительность его может быть повышена предварительным обогащением анализируемой пробы определенными примесями.
Поскольку не было возможности использовать существующие методики определения этих микроэлементов, нами разработан химико-спектральный метод определения микропримесей никеля, хрома, кобальта, железа, меди, серебра, палладия, кадмия и др. в малых пробах слюны (4 см ). Предварительно был разработан режим (процесс концентрирования, сила тока, время экспозиции, размеры и конфигурация электродов, ширина щели, повышение чувствительности, выбор спектральных линий), что позволило добиться высокой чувствительности (1- 10-6%), малой ошибки (1,6—1,9%) и достаточной надежности
метода. Последняя была определена при сравнении с данными анализа слюны с помощью люминесцентного метода. Смешанную слюну собирали утром натощак в количестве 8 см3 в течение 30—40 мин. Стимуляция не применялась. Через 1—2 ч после сбора слюну обрабатывали по предложенной нами химико-спектральной методике.
Смешанную слюну одного человека в количестве 8 см3 делят на две пробы по 4 см3. Выпаривание производят с 20 мг спектрально чистого угольного порошка в качестве коллектора в кварцевых чашечках на электроплитке с графитовой подложкой, в вытяжном шкафу. Затем сухой остаток озоляют в муфельной печи при температуре 500°С в течение 40 мин. Весь сухой остаток смешивают с 1 мг спектрально чистого хлорида натрия и переносят в графитовый электрод для спектрального анализа.
Приготовление синтетических эталонов. Голов- ной эталон с содержанием 1% каждой из определяемых примесей (в расчете на металл) готовят старательным смешиванием следующих веществ: 0,0282 г окиси никеля (Ni203) 0,0281 г окиси кобальта (С020з), 0,0292 г окиси хрома (Сг203), 0,025 г окиси меди (СиО), 0,032 г двуокиси марганца (МпОг), 0,028 г окиси железа (Рег03), 0,028 г карбоната кадмия (CdCCb), 0,062 г нитрата серебра (AgN03) и 1,7396 г угольного порошка. Остальные эталоны с убывающим в 10 раз содержанием каждой примеси до 1 • 10~5% в угольном порошке готовят последовательным растиранием 1 части каждого предыдущего эталона с 9 частями угольного порошка. Готовят и промежуточные эталоны с содержанием 3,33* 10”~п% каждой примеси. К 1 г каждого эталона перед анализом примешивают 2 мг хлорида натрия.
Спектральный анализ. Концентрат примесей или эталон помещают в кратер нижнего электрода (анод) диаметром 4,5 мм и глубиной 4 мм. Верхний электрод должен иметь торцовую поверхность. Анализ проводят при силе тока 16 А и напряжении 220 В в режиме переменного тока, в одинаковых условиях разряда, на одной фотопластинке (тип I, чувствительность 2,5—3 единицы).
Спектры концентратов и эталонов снимают по 2—3 раза, передвигая кассету. Экспозиция составляет 3 мин, ширина щели 0,015 мм. Затем фотопластинку со снятыми спектрами обрабатывают в стандартном метилгидрохиноновом проявителе, споласкивают водой, фиксируют, промывают проточной водой и высушивают.
Сухую фотопластинку со снятыми спектрами рассматривают на спектропроекте ПС-18 и фотометрируют на микрофотометре МФ-2, пользуясь логарифмической шкалой и измеряя почернение линий (S-ли- нии) определяемых элементов (по подходящей ступени ослабителя) и фона (S-фон). При этом используют аналитические линии, длины волн которых выражены в нанометрах.
Затем находят среднеарифметическое значение для эталонов и по ним строят градуировочные графики. На оси абсцисс откладывают логарифмы концентрации соответствующих примесей в эталонах, на оси ординат — средние величины AS(AS=S фон—S линий). По калибровочным графикам находят содержание гаптенов и микропримесей в концентрате.
Делением полученной величины содержания примесей в концентрате на теоретический коэффициент обогащения К, равный 2* 10-2, получают процент содержания данной примеси в слюне. Одновременно спектро
грамму каждой пробы слюны исследуют на качественный состав, пользуясь аналитическими линиями, длина волн которых выражена в нанометрах.
В слюне больных с аллергией к металлу отмечается увеличение содержания никеля, хрома и других микропримесей по сравнению с нормой, причем больше у тех больных, у которых сочетаются протезы из благородных и неблагородных сплавов.
Методика определения коррозии золотых протезов в полости рта. Нами разработана методика химико-спект- рального анализа слюны на составляющие компоненты золотых сплавов — золото, серебро, медь, а также методика определения селективной коррозии золотых протезов.
Методика определения коррозии золотых протезов заключается в следующем. У больного собирают смешанную слюну утром натощак в количестве 8 см3 (две пробы по 4 см3). Методом химико-спектрального анализа определяют количественное содержание золота, серебра, меди в слюне, а также ее качественный состав. «Налет» с цветоизмененных протезов из золота исследуют на наличие тех же микроэлементов. «Налет» собирают ватой с дентином путем трения о протез. Для сравнения исследуют пробу дентина.
Увеличение содержания золота, серебра, меди в слюне и «налете» подтверждает процесс растворения (коррозии) золотого протеза. Если содержание золота, меди, серебра увеличено только в «налете», то процесс коррозии выражен незначительно. При наличии нескольких золотых протезов в полости рта возникает вопрос, какой именно протез подвергается коррозии. В этом случае исследуют «налет», собранный с каждого протеза, для установления селективной коррозии. Исследуют также слюну. Содержание золота, меди, серебра в «налетах» сопоставляется с таковым в слюне. Это помогает оценить степень выраженности процессов коррозии. Селективность коррозии определяет количественное содержание золота, серебра, меди в «налете» с того или иного протеза.
Таким образом, появление в слюне и «налете» с протеза повышенного количества составляющих компонентов сплава из золота 900-й пробы (золото, медь, серебро) подтверждает возможность его коррозии в полости рта.
Методика химико-спектрального анализа коррозии протезов из золота в полости рта эффективна, производительна, позволяет в малом количестве слюны (4 см3) и «налете» определять составляющие золотого сплава, а также качественный состав и содержание минеральных
компонентов слюны. Анализ «налета» с золотых протезов дает возможность судить о селективности коррозии* что очень важно для стоматолога.
Реакция специфической агломерации лейкоцитов (РСАЛ). При изучении аллергии к металлическим зубным протезам из всех реакций крови на гаптен in vitro наибольшее распространение получила РСАЛ. Этот тест в литературе называют также ПАЛ — показатель агломерации лейкоцитов (по И. Е. Сосонкину) и РАЛ — реакция агломерации лейкоцитов (по А. Н. Мацу). РСАЛ рекомендуется для выявления ранних реакций сенсибилизированного организма.
Поскольку L. Fleck (1951) показал, что агрегирование лейкоцитов является выражением повышенной клеточной активности, усиление агломерации лейкоцитов под влиянием гаптена можно считать признаком специфической активации сенсибилизированных клеток. Наивысшей стадией данной реакции является альтерация (лизис) лейкоцитов, поэтому полное отсутствие группировки лейкоцитов расценивается как резко положительная реакция. За основу РСАЛ нами был взят метод, разработанный В. Е. Тугановой, А. Н. Мацем, И. П. Юсиповой (1965). Он был применен для выявления аллергии у лиц, пользующихся металлическими протезами.
Метод заключался в следующем. Из пальца больного капилляром Панченкова брали две порции крови по 0,2 мл и одну из них помещали в предварительно парафинированную преципитационную пробирку, содержащую 0,05 мл 3,8% раствора цитрата натрия. Эта порция крови являлась контрольной и позволяла судить об исходной степени РСАЛ. Другую порцию крови помещали в опытную пробирку, подготовленную таким же образом. Помимо цитрата натрия, в нее добавляли каплю одного из спиртовых растворов: 1% бихромата калия (К2СГ2О7), 1% хлорида никеля (NiCb) или 5% нитрата кобальта [C0(N03)2j. Рабочая доза химического аллергена взята по рекомендации А. С. Рабена и А. А. Антоньева (1966).
Количество опытных образцов крови зависело от числа одновременно исследуемых препаратов. Обычно оно не превышало 4—5. Пробирки с контрольными опытными образцами крови помещали в термостат на 2 ч при температуре 37°С. Через 1 ч пробы перемешивали осторожным покачиванием. Затем из контрольного и опытного образцов крови на предметном стекле готовили толстую каплю, высушивали ее на воздухе и без фиксации окрашивали 0,01% раствором метиленового синего. В полученных препаратах под иммерсионной системой микроскопа производили подсчет 1000 лейкоцитов, следуя по диаметру капли. При этом специально учитывали клетки, образующие группы из 3 и более лейкоцитов. Отношение склеенных клеток к общему количеству подсчитанных выражают в процентах. Это число принимают за показатель РСАЛ. Пробу считали положительной, если в пробирке с химическим соединением процент агломерации на '/з превышал таковой в контроле.
Методика определения специфического подавления ретракции кровяного сгустка (ПРКС). Настоящая методика была применена с целью диагностики in vitro специфической контактной аллергии на металлические протезы. За основу показателя реакции кровяного сгустка (ПРКС) была взята предложенная И. В. Сосонкиным (1977) методика, модифицированная нами для стоматологических клиник.
Механизм этой реакции объясняется аллергической реакцией лейкоцитов, в том числе возможным увеличением объема реагирующих на гаптены клеток крови, а также их лизисом. В результате образование сгустка замедляется и отделяется меньший объем сыворотки. Однако полностью механизм этого интересного феномена не раскрыт. Предварительно для определения рабочей дозы аллергена исследовали реакцию ПРКС у 12 боль
ных при использовании ran
к другой — 0,05%, к третьей ных концентрация К2СГ2О7 С ния реакции ПРКС, т. е.
— 0,005%. У 10 из 12 боль- ,005% не вызывала измене- соответствовала контролю.
У 2 больных отмечено незначительное ослабление реак
ии К2СГ2О7 0,05% только у
4 больных отмечено снижение ПРКС. Исходя из этого, в качестве рабочей дозы была выбрана концентрация бихромата калия 0,5%.
Такие же предварительное исследования были прове
дены для никеля и кобальта, что в качестве рабочих сл
0,5% растворы NiCb и Со(МОз)г.
В нашей методике в качестве aj творы хлорида никеля (NiС12), би кобальта [Со(ЫОз)г] в изотопическ рильные пробирки брали 1 мл алле пальца. Контролем служила пробир рида натрия. Содержимое пробиро нием и оставляли при комнатной тем Степень реакции ПРКС под влияние визуально через 2 ч. В контрольны меньший объем и был плотным. В п и большего объема.
В связи с тем что для анали (0,2 мл), результаты реакции ПРКС образовавшегося сгустка, не подсч ПРКС была положительной (-)-) и.
Реакция ПРКС у лиц, пользующихся металлическими протезами, является достаточно чувствительным методом специфической диагностики аллергического заболевания на металлы.
Методика реакции тройного розеткообразования
(РТР). В последнее время убедительно доказано, что основными иммунокомпетентными клетками являются малые лимфоциты, подразделяющиеся на Т-, В-, D- и О-по- пуляции и ряд субпопуляций, осуществляющих как эффекторную (киллеры, клетки гиперчувствительности замедленного типа), так и регуляторную (супрессоры, хелперы) функцию в организме [Петров Р. В., 1976].
Функционально различные лимфоциты морфологически не различаются в световом, фазово-контрастном и электронном сканирующем микроскопе [Петров Р. В., 1976]. Их идентификация и количественное определение проводятся обычно непрямыми методами, основанными на выявлении мембранных рецепторов-маркеров [Мань- ко В. М., 1976]. В периферической крови здорового человека существуют лимфоциты с двойным набором маркеров, обладающие наряду с Т-маркерами (рецепторами для эритроцитов барана) еще и СЗ- или Fc-рецепторами [Хилько Т. Ф., Алексеева О. Г., 1982].
РТР основана на введении в систему одновременно трех частиц — индикаторов различных типов мембранных рецепторов, что позволило выявить восемь субпопуляций лимфоцитов и оценить их количество при различном функциональном состоянии иммунной системы организма.
РТР выполняют по методике, разработанной Т. Ф. Хилько и О. Г. Алексеевой (1985). В качестве индикаторных частиц применяют эритроциты барана (ЭБ) и зимо- зан (Зн). При использовании последнего в качестве носителя третьего индикатора его предварительно окрашивают в контрастный цвет по Хилько. При постановке РТР для определения пропердина используют Зн, выпускаемый Олайнским биохимическим заводом, предварительно растирая его в фарфоровой ступке с мерным количеством изотонического раствора, который добавляют по каплям. Индикатором СЗ-рецепторов служит сухой комплемент морской свинки, а Fc-рецепторов — моноспецифические сыворотки для определения сывороточных иммуноглобулинов.
Развитие аллергии к металлам вызывает существен
ные сдвиги в активности розеткообразующих рецепторов лимфоцитов.
В диагностике рекомендуется также использовать предложенный Т. Ф. Хилько (1984) вариант РТР с использованием в качестве индикаторов эритроцитов барана, комплекса Зн с комплементом и комплекса Зн с гап- теном (0,1% растворы хлорного хрома, хлорита никеля или марганца). Первые два индикатора служат маркерами Т-, В- и D-популяций лимфоцитов. Рецепторы к гаптенам несут Т-, В- и О-клетки. При развитии аллергии количество лимфоцитов, особенно несущих гаптеноспеци- фические рецепторы О-лимфоцитов, существенно возрастает.